2024年5月，沈陽藥科大學(xué)在國際學(xué)術(shù)期刊cell death & differentiation 發(fā)表一項(xiàng)重要研究成果，題為：PD-L2 drives resistance to EGFR-TKIs: dynamic changes of the tumor immune environment and targeted therapy。使用單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq)、TUNEL、酶聯(lián)免疫吸附、流式細(xì)胞術(shù)、WB、CETSA、CCK-8來剖析腫瘤的耐藥機(jī)制。

期刊名稱：cell death & differentiation.

影響因子：13.7

合作單位：沈陽藥科大學(xué)

研究部位：小鼠異種移植腫瘤

研究方法：scRNA-seq、TUNEL、酶聯(lián)免疫吸附、流式細(xì)胞術(shù)、WB、HTRF、CCK-8

百邁客生物為該研究提供了單細(xì)胞測序技術(shù)服務(wù)。

研究背景

表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑 （EGFR-TKI） 是癌癥靶向治療的經(jīng)典例子。已獲批的 EGFR-TKIs 單獨(dú)使用或與化療聯(lián)合用于治療非小細(xì)胞肺癌 （NSCLC）、結(jié)直腸癌 （CRC）、乳腺癌 （BC） 等。然而，大多數(shù)患者在 1-2 年后對(duì) EGFR-TKI 產(chǎn)生獲得性耐藥，隨后癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。為了解決這一緊迫的臨床問題，迫切需要延遲和克服 EGFR-TKIs 耐藥的策略。到目前為止，獲得性 EGFR 突變、MET 擴(kuò)增、ERBB2 擴(kuò)增和旁路激活等作為 EGFR-TKI 耐藥的機(jī)制已得到充分研究。近年來，一些研究人員開始關(guān)注腫瘤免疫環(huán)境狀態(tài)與 EGFR-TKIs 治療療效之間的關(guān)系。臨床研究最近發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKIs 治療可以重塑腫瘤免疫環(huán)境，但 EGFR-TKIs 與瘤周免疫細(xì)胞之間的關(guān)系尚未得到充分研究。

實(shí)驗(yàn)材料

使用攜帶 EGFR 突變的小鼠細(xì)胞系建立了異位異種移植腫瘤模型，并評(píng)估了對(duì)不同代 EGFR-TKI 的反應(yīng)，揭示腫瘤耐藥機(jī)制。

1、scRNA-seq

收集兩只小鼠的腫瘤樣本，共獲得 12,941 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行 scRNA-Seq。

2、HTRF

進(jìn)行天然小分子化合物庫 （MCE） 的篩選，制作了 266 個(gè)樣品。篩選 PD-1/PD-L2 結(jié)合抑制劑。

研究結(jié)果

• 腫瘤免疫環(huán)境參與腫瘤對(duì) EGFR-TKIs 的耐藥性

首先，該研究使用攜帶 EGFR 突變的小鼠細(xì)胞系建立了異位異種移植腫瘤模型，并評(píng)估了對(duì)不同代 EGFR-TKI 的反應(yīng)。EGFR 突變或擴(kuò)增存在于多種癌癥中，如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等。EGFR-TKIs 可以靶向 EGFR 敏感突變。因此，作者使用小鼠肺腺癌細(xì)胞 （LLC） 和結(jié)直腸癌細(xì)胞 （CT26） 作為工具細(xì)胞。作者用突變形式的人 EGFR 轉(zhuǎn)染小鼠細(xì)胞系 （LLC 和 CT26），攜帶外顯子 19 缺失 （EGFR19del） 或外顯子 21 L858R 錯(cuò)義突變 （EGFRL858R），這會(huì)增加 EGFR 活性，以接近細(xì)胞模型到人類疾病，建立同基因荷瘤小鼠模型。在轉(zhuǎn)染 EGFR 突變體的細(xì)胞中，p-EGFR 和 p-ERK1/2 的表達(dá)增強(qiáng)，增殖速率顯著增加，表明細(xì)胞 EGFR 下游信號(hào)通路激活（圖 1A、B）。正如預(yù)期的那樣，EGFR 突變細(xì)胞對(duì)不同代 EGFR-TKI 更敏感，包括厄洛替尼、阿法替尼和奧希替尼（圖 1B）。為了全面探討 EGFR-TKIs 耐藥的機(jī)制，作者使用 EGFR 突變細(xì)胞建立了第一代和第三代 EGFR-TKIs 耐藥同基因小鼠模型（圖1C）。如圖1 D所示，第一代 （P1） LLC-EGFR19del 來源的腫瘤對(duì)奧希替尼敏感 （抑制率 = 44.0%）。在第 2 代 （P2） 中，作者將奧希替尼的劑量增加了一倍，腫瘤抑制率降低了一半 （22.2%）。用奧希替尼治療的第三代 （P3） LLC-EGFR19del衍生腫瘤被認(rèn)為對(duì)奧希替尼耐藥，因?yàn)樗鼈兊捏w積與用生理鹽水治療的小鼠的體積沒有顯著差異。同時(shí)，作者還使用類似的方法成功獲得了對(duì)奧希替尼耐藥的 LLC-EGFRL858R衍生腫瘤和對(duì)厄洛替尼耐藥的 CT26-EGFR19del衍生腫瘤（圖 1D）。

為了進(jìn)一步研究 EGFR-TKIs 耐藥與腫瘤免疫微環(huán)境之間的關(guān)系，作者將 P3 CT26-EGFR19del衍生的腫瘤接種到免疫功能正常的 BALB/c 小鼠和嚴(yán)重免疫缺陷的 NOD （PRKDCKO?IL2RKO） 小鼠中，然后作者評(píng)估了它們對(duì)厄洛替尼的反應(yīng)性（圖 1E）。作者的結(jié)果表明，接種到 BALB/c 小鼠中的腫瘤對(duì)厄洛替尼治療保持耐藥性（抑制率 = 6.9%），而接種到 NOD （PRKDCKO?IL2RKO） 小鼠中的腫瘤顯示出降低的耐藥性（抑制率 = 40.2%）（圖1E）。與體內(nèi)腫瘤生長數(shù)據(jù)一致，增殖生物標(biāo)志物 Ki67 的表達(dá)在用厄洛替尼處理后也顯示免疫缺陷異種移植腫瘤組織顯著減少，但在免疫活性異種移植腫瘤組織中沒有減少（圖 1F）。總之，這些結(jié)果表明腫瘤免疫環(huán)境參與 EGFR 突變腫瘤對(duì) EGFR-TKI 的耐藥性。

• 腫瘤免疫環(huán)境由激活到抑制的動(dòng)態(tài)變化驅(qū)動(dòng) EGFR-TKIs 耐藥

為了了解腫瘤免疫環(huán)境如何參與對(duì) EGFR-TKI 的耐藥性，作者分析了治療過程中不同階段的腫瘤免疫環(huán)境特征（圖 2A）。作者測定了初始 EGFR-TKIs 治療時(shí)和耐藥發(fā)展期間 （P1-P3） 腫瘤免疫環(huán)境中腫瘤浸潤白細(xì)胞 （TIL） 的密度，其中用鹽水處理的腫瘤細(xì)胞作為 CTRL 組，用厄洛替尼或奧希替尼治療的腫瘤細(xì)胞作為 TKI 組。流式細(xì)胞術(shù)分析的免疫分析顯示，在治療早期，攜帶 EGFR19del?的腫瘤的 EGFR-TKIs 治療誘導(dǎo)腫瘤浸潤白細(xì)胞比例增加（圖2B）。然而，當(dāng)荷瘤小鼠對(duì) EGFR-TKI 產(chǎn)生耐藥性時(shí)，與 CTRL 組相比，腫瘤浸潤白細(xì)胞的比例顯著降低（圖2B）。這表明荷瘤小鼠對(duì) EGFR-TKIs 的反應(yīng)性改變伴隨著腫瘤免疫環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化。

為了準(zhǔn)確反映腫瘤免疫環(huán)境的真實(shí)狀態(tài)，作者檢查了藥物治療期間荷瘤小鼠腫瘤免疫環(huán)境中的 T 細(xì)胞浸潤和功能。作者觀察到，兩種模型的 P1 荷瘤小鼠中 CD8+?T 細(xì)胞比例均顯著增加，但隨著 TKI 治療的繼續(xù)，這種增加消失。TKI 耐藥 P3 荷瘤小鼠中 CD8+?T 細(xì)胞的比例顯著降低（圖2C）。因此，作者假設(shè) T 淋巴細(xì)胞，尤其是 CD8+?T 細(xì)胞，從最初的激活開始逐漸獲得功能失調(diào)的表型。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，作者檢查了效應(yīng)細(xì)胞因子在 T 細(xì)胞 （IFN-γ、IL-2、顆粒酶 B 和 TNF-α）中的表達(dá)。EGFR-TKIs 的初始治療刺激效應(yīng)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但在耐藥發(fā)展的后期，效應(yīng)細(xì)胞因子的水平似乎降低，并且與 CTRL 相比，IFN-γ 和顆粒酶 B 的產(chǎn)生顯著減少（圖2D， E）。這些結(jié)果表明 EGFR-TKIs 顯著影響腫瘤免疫環(huán)境。初始治療會(huì)引發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而顯著減少腫瘤生長。隨著時(shí)間的推移，EGFR-TKI 無法顯著控制腫瘤生長，并伴有 T 細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子產(chǎn)生的顯著減少。綜上所述，這些結(jié)果表明，隨著 EGFR-TKIs 治療時(shí)間的延長，腫瘤細(xì)胞由藥物敏感變?yōu)槟退帲庖叻磻?yīng)首先增強(qiáng)后抑制。

• 對(duì) EGFR-TKI 的獲得性耐藥伴隨著 PD-L2 表達(dá)的上調(diào)

為了探索腫瘤免疫環(huán)境變化的原因，作者同時(shí)檢測了不同傳代階段腫瘤組織中刺激性和抑制性免疫調(diào)節(jié)分子的表達(dá)。在 EGFR-TKI 的初始治療中，一些抑制性免疫檢查點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)降低（圖隨著耐藥性的出現(xiàn)，抑制性免疫檢查點(diǎn)基因 PD-L1 和 PD-L2 的相對(duì)表達(dá)水平逐漸升高，尤其是 PD-L2 （圖3A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證 PD-L2 在 EGFR-TKI 耐藥腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的增加，作者通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定了 PD-L2 在 P3 腫瘤細(xì)胞厄洛替尼或奧希替尼處理的腫瘤細(xì)胞（耐藥，TKI 組）表面的表達(dá)，以生理鹽水處理的細(xì)胞為對(duì)照（敏感，CTRL 組）。作者的結(jié)果表明，與對(duì)照組織相比，腫瘤細(xì)胞表面 PD-L2 的表達(dá)在耐藥腫瘤組織中表現(xiàn)出顯著增加（圖3B）。接下來，為了進(jìn)一步驗(yàn)證，作者分析了先前構(gòu)建的 EGFR 突變的 TKI 耐藥 NSCLC 細(xì)胞系 HCC4006R、HCC827R、PC9R 及其配對(duì)親本細(xì)胞中免疫檢查點(diǎn)標(biāo)志物的表達(dá)水平。在三種耐藥細(xì)胞系中，PD-L2 的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，而 PD-L1 的表達(dá)表現(xiàn)出不一致的變化（圖3C、D）。

為了探索這種現(xiàn)象的臨床價(jià)值，作者分析了臨床數(shù)據(jù)庫。使用 GEO 數(shù)據(jù)集，作者分析了 8 例 EGFR TKIs 治療前后切除的臨床患者肺癌組織中 PDCD1LG2?（編碼 PD-L2） 和其他免疫檢查點(diǎn)基因的變化。與作者的結(jié)果類似，作者觀察到 EGFR TKI 治療后患者組織中 PDCD1LG2?表達(dá)增加，但其他免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因沒有增加（圖3E）。此外，作者認(rèn)為其他因素，例如 MET 擴(kuò)增，可能涉及 EGFR-TKI 耐藥。作者利用 TCGA 數(shù)據(jù)集研究了 EGFR-TKIs 耐藥驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)與人 CD274?（編碼 PD-L1） 或 PDCD1LG2?表達(dá)之間的關(guān)系。計(jì)算各驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)水平與 CD274?或 PDCD1LG2?表達(dá)水平之間的相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，PD-L2 表達(dá)而不是 PD-L1 表達(dá)與 EGFR-TKIs 耐藥驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（圖 3F）。與體外實(shí)驗(yàn)中的 PD-L1 過表達(dá)細(xì)胞相比，PD-L2 過表達(dá)的 PC9 細(xì)胞對(duì)上述耐藥驅(qū)動(dòng)基因相關(guān)的抑制劑的抵抗力增強(qiáng)（圖3F）。這些結(jié)果與一些研究表明 EGFR-TKIs 耐藥機(jī)制與 PD-L1 表達(dá)有關(guān)的研究形成鮮明對(duì)比?？偠灾?，作者的結(jié)果提供了初步證據(jù)，表明 PD-L2 而不是 PD-L1 可能是介導(dǎo) EGFR-TKIs 治療過程中腫瘤環(huán)境免疫抑制作用和驅(qū)動(dòng)耐藥的關(guān)鍵分子。

• PD-L2 通過影響腫瘤免疫環(huán)境在介導(dǎo) EGFR-TKIs 耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用

為了研究 PD-L2 表達(dá)在免疫系統(tǒng)中的獨(dú)特作用和對(duì) EGFR-TKI 的反應(yīng)，作者在 CT26-EGFR19del?細(xì)胞系中過表達(dá) PD-L1 和 PD-L2，并建立了 BALB/c 同基因小鼠模型（圖 4A）。使用攜帶空載體的 CT26-EGFR19del細(xì)胞系作為對(duì)照。作者通過測量腫瘤體積評(píng)估空載體組、PD-L1 過表達(dá)組和 PD-L2 過表達(dá)組小鼠腫瘤對(duì)厄洛替尼治療的敏感性。結(jié)果顯示，與空載體組相比，PD-L2 過表達(dá)組小鼠對(duì)厄洛替尼的腫瘤耐藥性顯著增加，但 PD-L1 過表達(dá)組對(duì)厄洛替尼的腫瘤耐藥性沒有增加（圖4B，C）。這些結(jié)果表明，PD-L2 的過表達(dá)會(huì)增加腫瘤細(xì)胞對(duì) EGFR-TKIs 的耐藥性。為了進(jìn)一步證實(shí)作者的發(fā)現(xiàn)，作者檢查了 PD-L1 或 PD-L2 過表達(dá)對(duì) EGFR-TKIs 治療荷瘤小鼠腫瘤免疫環(huán)境中 T 細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，CD4+?T 細(xì)胞占總 CD3+?T 細(xì)胞的比例在 3 組間差異不顯著。值得注意的是，與空載體組相比，PD-L2 過表達(dá)組的 CD8+?T 細(xì)胞占總 CD3+?T 細(xì)胞的百分比以及細(xì)胞因子 IFN-γ 和顆粒酶 B 的表達(dá)顯著降低（圖 4D）。然而，PD-L1 過表達(dá)組中的細(xì)胞因子 IFN-γ 和顆粒酶 B 沒有顯著變化（圖 4D）。免疫組化染色顯示，與空載體和 PD-L1 過表達(dá)組相比，PD-L2 過表達(dá)組腫瘤細(xì)胞增殖顯著增加（圖4E）。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，PD-L2 在厄洛替尼治療期間在抑制免疫反應(yīng)、抑制細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞浸潤和減少小鼠效應(yīng)細(xì)胞因子產(chǎn)生方面起主導(dǎo)作用。因此，作者得出結(jié)論，在 EGFR-TKIs 治療過程中，PD-L2 水平升高通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸來抑制腫瘤細(xì)胞對(duì) EGFR-TKIs 的治療反應(yīng)。

鑒于 PD-L2 在體內(nèi)調(diào)節(jié) T 細(xì)胞活性中的關(guān)鍵作用，作者通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，PD-L2 的穩(wěn)定沉默增加了 EGFR-TKI 的敏感性（圖4F，G）。為了進(jìn)一步研究 PD-L2 如何影響對(duì) EGFR-TKI 的耐藥動(dòng)力學(xué)，作者在 EGFR-TKI 耐藥同基因小鼠模型的開發(fā)中穩(wěn)定地沉默了 CT26-EGFRmut 細(xì)胞系中的 PD-L2（圖4H）。結(jié)果顯示，厄洛替尼在第一代顯著抑制 CT26-EGFR19del?衍生腫瘤的生長。重要的是，PD-L2 沉默導(dǎo)致對(duì) EGFR-TKI 治療的耐藥性延遲發(fā)生。即使在第三代 （P3） 時(shí)對(duì)照組 （CT26-EGFR19del?shNC 衍生腫瘤） 出現(xiàn)耐藥性 （腫瘤抑制率 = 13.5%），PD-L2 沉默的腫瘤對(duì) EGFR-TKIs 保持高敏感性 （腫瘤抑制率 = 52.7%） （圖4I，J）。綜上所述，作者的基因操作實(shí)驗(yàn)表明，PD-L2 通過影響腫瘤免疫微環(huán)境在介導(dǎo) EGFR-TKIs 耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

• 阻斷 PD-L2/PD-1 聯(lián)合 EGFR-TKI 可抑制 EGFR-TKI 耐藥細(xì)胞或腫瘤的生長

接下來，作者想進(jìn)一步探討阻斷 EGFR-TKI 耐藥細(xì)胞中的 PD-L2/PD-1 是否可以通過增強(qiáng)免疫反應(yīng)來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì) EGFR-TKIs 的敏感性。作者建立了攜帶對(duì)奧希替尼耐藥的 LLC-EGFR19del?衍生腫瘤的同基因小鼠模型。小鼠接受生理鹽水 （CTRL）、奧希替尼 （Os）、抗 PD-1 （αPD-1） 和奧希替尼 + 抗 PD-1 （Combi） 治療（圖5A）。作者的結(jié)果表明，與 CTRL 組相比，單獨(dú)使用奧希替尼組小鼠的腫瘤體積和生存時(shí)間沒有顯著差異。PD-1 抑制劑對(duì) EGFR-TKI 耐藥腫瘤表現(xiàn)出部分抑制，并導(dǎo)致小鼠存活時(shí)間適度延長，盡管沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，奧希替尼和抗 PD-1 的組合顯著抑制了腫瘤生長并延長了攜帶耐藥腫瘤的小鼠的生存期（圖5B，C）。以上結(jié)果表明，抑制 PD-1 與 EGFR-TKI 聯(lián)合有效抑制了 EGFR-TKI 耐藥腫瘤的生長。

此外，作者進(jìn)一步確定了在耐藥細(xì)胞中穩(wěn)定敲低 PD-L2 是否可以增強(qiáng)這些細(xì)胞對(duì) EGFR-TKIs 的敏感性，為了區(qū)分 PD-L1 和 PD-L2 的作用，作者生成了 PD-L1 和 PD-L2 穩(wěn)定沉默的 PC9R 細(xì)胞系。與 PD-L1 沉默細(xì)胞相比，PD-L2 沉默的腫瘤細(xì)胞對(duì) EGFR-TKI 更敏感，它們更有效地增加了 T 細(xì)胞的增殖和 CD8+?T 細(xì)胞的比例（圖5D，E）。此外，作者使用抗體阻斷 PD-L1、PD-L2 和 PD-1 的功能獲得了一致的結(jié)論?？?PD-L2 和 PD-1 的抗體使腫瘤細(xì)胞對(duì) EGFR-TKI 更敏感，并增加了 T 細(xì)胞的增殖，CD8+ T 細(xì)胞的比例更高（圖5F， G）。上述體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，PD-L2 的高表達(dá)通過影響免疫反應(yīng)來影響 EGFR 突變細(xì)胞對(duì) EGFR-TKIs 的敏感性。因此，PD-1/PD-L2 信號(hào)傳導(dǎo)，而不是 PD-1/PD-L1 信號(hào)傳導(dǎo)，可能在介導(dǎo)對(duì) EGFR-TKI 的耐藥中發(fā)揮重要作用。

• PD-L2 過表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)對(duì) EGFR-TKI 的耐藥

接下來，作者進(jìn)一步探討了 PD-L2 表達(dá)升高影響免疫反應(yīng)以降低腫瘤對(duì) EGFR-TKIs 敏感性的機(jī)制。作者獲得了來自空載體或 PD-L2 過表達(dá)的同基因小鼠中 CT26-EGFR19del?細(xì)胞的腫瘤組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜。作者對(duì)來自空載體樣本和 PD-L2 過表達(dá)樣本的整合單細(xì)胞數(shù)據(jù)集進(jìn)行了聚類分析，并確定了六個(gè)主要的不同細(xì)胞群（圖6A、B）。作者發(fā)現(xiàn) PD-L2 過表達(dá)組中癌細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，T 細(xì)胞的比例顯著降低（圖6C）。為了探索 EGFR-TKIs 耐藥的機(jī)制，作者分析了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征。與空載體組相比，對(duì) PD-L2 過表達(dá)組的差異表達(dá)基因進(jìn)行 KEGG 富集分析。作者觀察到細(xì)胞凋亡通路顯著富集（圖 6D）。GSEA 分析顯示，PD-L2 過表達(dá)組癌細(xì)胞中與細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)的基因顯著下調(diào)（圖6E）。這些結(jié)果表明，EGFR 突變腫瘤細(xì)胞中 PD-L2 表達(dá)的增加可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少。作者的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了這些結(jié)論。TUNEL 染色顯示，與對(duì)照組相比，TKI 處理后 CT26-EGFR19del?PD-L2 過表達(dá)組腫瘤細(xì)胞凋亡受到顯著抑制（圖6F）?；谶@些結(jié)果，作者假設(shè) EGFR 突變的腫瘤細(xì)胞中 PD-L2 表達(dá)增加會(huì)抑制癌細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的持續(xù)生長，耐藥性增加。

• PD-L2 過表達(dá)抑制 CD8+T 細(xì)胞通過穿孔素-顆粒酶 B 通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能

為了進(jìn)一步了解 PD-L2 對(duì)腫瘤免疫環(huán)境的抑制作用，作者回到了作者的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)。根據(jù) CD45 的表達(dá)，將空載體和 PD-L2 過表達(dá)組的腫瘤環(huán)境中細(xì)胞分為 CD45-?腫瘤細(xì)胞和 CD45+?免疫細(xì)胞（圖7A）。然后根據(jù)已知遺傳標(biāo)記的表達(dá)和細(xì)胞亞群的特異性注釋對(duì) CD45+?免疫細(xì)胞進(jìn)行分組（圖 7B）。在 PD-L2 過表達(dá)組中，作者觀察到 CD8+?T 細(xì)胞群的大小顯著減小（圖7B，C）。因此，作者通過 KEGG 富集分析了空載體組和 PD-L2 過表達(dá)組 CD8+?T 細(xì)胞中的差異表達(dá)基因（圖 7D）。作者發(fā)現(xiàn)與增殖和細(xì)胞毒功能相關(guān)的通路顯著富集（圖7E）。為了進(jìn)一步證實(shí) PD-L2 過表達(dá)顯著影響 CD8+?T 細(xì)胞活性，作者從總 T 細(xì)胞中分離 CD8+?T 細(xì)胞，并將它們與 PD-L1 或 PD-L2 基因操縱的小鼠腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，CD8+?T 細(xì)胞的增殖在 PD-L2 過表達(dá)細(xì)胞中受到顯著抑制，而在 PD-L1 過表達(dá)細(xì)胞中則不受抑制（圖7F）。然后，作者從總 T 細(xì)胞中分離 CD4+?T 細(xì)胞，并將它們與 PD-L1 或 PD-L2 基因操縱的小鼠腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)。值得注意的是，PD-L2 過表達(dá)對(duì) CD4+?T 細(xì)胞的增殖沒有影響，而 PD-L1 過表達(dá)顯著抑制了 CD4+?T 細(xì)胞的增殖（圖7G）。這表明 PD-L2 和 PD-L1 介導(dǎo) T 細(xì)胞抑制的分子機(jī)制存在差異。

許多研究表明，CD8+?T 細(xì)胞可通過 Fas-FasL 通路或穿孔素-顆粒酶 B 通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，作者接下來使用純化的 CD8⁺?T 細(xì)胞與 PD-L1 或 PD-L2 基因操縱的小鼠腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，并研究 EGFR-TKIs 處理后腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，與 PD-L1 過表達(dá)細(xì)胞相比，PD-L2 過表達(dá)減少了 EGFR-TKI 處理后 CD8+?T 細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡（圖7H）。接下來，作者試圖檢查腫瘤細(xì)胞 PD-L1 或 PD-L2 過表達(dá)對(duì) CD8+?T 細(xì)胞分泌細(xì)胞毒性細(xì)胞因子的影響。正如預(yù)期的那樣，與 PD-L1 過表達(dá)相比，PD-L2 過表達(dá)顯著抑制了 CD8+?T 細(xì)胞顆粒酶 B 和穿孔素伴隨 EGFR-TKI 治療的分泌（圖7I）。綜上所述，EGFR 突變腫瘤細(xì)胞中 PD-L2 的過表達(dá)顯著抑制了 CD8+?T 細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒功能，主要是通過抑制穿孔素和顆粒酶 B 的分泌，從而減少腫瘤細(xì)胞的凋亡。

• ZU 作為天然存在的 PD-L2 小分子抑制劑的篩選和活性評(píng)價(jià)

由于目前市場上沒有靶向 PD-L2 的藥物，作者使用 HTRF 技術(shù)篩選了 1300 多種天然小分子化合物的庫，以鑒定 PD-L2 的特異性抑制劑。作者發(fā)現(xiàn)了一種小分子化合物十一烯酸鋅 （ZU），它選擇性地抑制 PD-L2/PD-1 結(jié)合，EC50?8.4 μM，而 PD-L1/PD-1 為 >80 μM（圖8A， B）。ZU 是由蓖麻油通過一系列化學(xué)反應(yīng)和凈化過程生產(chǎn)的。CETSA 實(shí)驗(yàn)表明，與 PD-L1/PD-1 相比，ZU 有效抑制了 PD-L2 與 PD-1 的結(jié)合（圖8C）。這些結(jié)果表明 ZU 具有阻斷 PD-L2/PD-1 相互作用的特異性能力。此外，作者利用空載體或 PD-L2 過表達(dá)的小鼠 CT26 細(xì)胞來驗(yàn)證 ZU 的體外抗腫瘤作用。在 40 μM 濃度下，ZU 不會(huì)顯著降低 CT26 空載體和 PD-L2 過表達(dá)細(xì)胞的活力（圖8D），這表明 ZU 沒有直接的細(xì)胞毒性作用。然而，當(dāng)腫瘤細(xì)胞與活化的 T 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，與 CT26 空載體細(xì)胞相比，ZU （40 μM） 顯著抑制了 CT26 PD-L2 過表達(dá)細(xì)胞的活力（圖8D）。這表明 ZU 通過靶向 PD-L2/PD-1 的免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用。使用具有空載體和 PD-L2 過表達(dá)的 PC9 細(xì)胞獲得了類似的結(jié)果（圖8D）。此外，作者研究了 ZU 和 EGFR-TKI 對(duì)親本和 TKI 耐藥 NSCLC 細(xì)胞的聯(lián)合抑制作用。對(duì)于耐藥細(xì)胞，結(jié)果表明，厄洛替尼聯(lián)合 ZU 對(duì) 827 R 或 PC9R 細(xì)胞的生長抑制具有協(xié)同作用，與單獨(dú)使用厄洛替尼相比，耐藥細(xì)胞的存活率顯著降低（圖8E）。重要的是，在沒有活化的 T 細(xì)胞的情況下，厄洛替尼聯(lián)合 ZU 的細(xì)胞殺傷效果沒有顯著差異（圖8E）。上述結(jié)果進(jìn)一步表明，靶向 PD-L2 的 ZU 與 EGFR-TKI 的組合對(duì)耐藥腫瘤表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用。

接下來，作者評(píng)估了 ZU 是否通過靶向 PD-L2 可以改善腫瘤免疫反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與單獨(dú)使用厄洛替尼或 ZU 相比，厄洛替尼聯(lián)合 ZU 顯著增加了 CD8+?T 細(xì)胞的比例和顆粒酶 B 的表達(dá)（圖8F，G）。作者進(jìn)一步檢測到與活化 T 細(xì)胞共培養(yǎng)的 827 個(gè) R 或 PC9R 細(xì)胞的凋亡水平。作者發(fā)現(xiàn)厄洛替尼聯(lián)合 ZU 顯著促進(jìn)免疫細(xì)胞介導(dǎo)的 EGFR-TKI 耐藥細(xì)胞凋亡（圖8H）。相比之下，當(dāng)用厄洛替尼加 ZU 處理耐藥細(xì)胞時(shí)，在沒有活化的 T 細(xì)胞或細(xì)胞凋亡抑制劑（泛半胱天冬酶抑制劑 Z-VAD-FMK 和特異性顆粒酶 B 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抑制劑 Z-IETD-FMK）的情況下未觀察到細(xì)胞凋亡（圖8H）。這進(jìn)一步證明了耐藥細(xì)胞的凋亡是由免疫細(xì)胞介導(dǎo)的。此外，顆粒酶 B （Z-IETD-FMK） 的抑制有效地消除了細(xì)胞凋亡，突出了顆粒酶 B 在 ZU 和 EGFR-TKI 誘導(dǎo)的耐藥癌細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵作用（圖8H）。總之，這些結(jié)果表明天然小分子抑制劑 ZU 可以有效和特異性地抑制 PD-L2。當(dāng)與 EGFR-TKIs 聯(lián)合使用時(shí)，ZU 可以通過在體外激活免疫細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來顯著逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。

• ZU 改善抑制性腫瘤免疫環(huán)境，在體內(nèi)逆轉(zhuǎn) EGFR-TKIs 耐藥

為了進(jìn)一步證實(shí) ZU 和 EGFR-TKIs 的組合協(xié)同改善腫瘤免疫環(huán)境并逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性，作者評(píng)估了 ZU + 厄洛替尼在攜帶 PD-L2 過表達(dá)的 CT26-EGFR19del?來源的腫瘤的 BALB/c 同基因小鼠中的療效（圖9A）。腫瘤體積曲線顯示，與鹽水處理組相比，單獨(dú)使用厄洛替尼在治療 15 天后表現(xiàn)出邊緣性腫瘤生長抑制（圖9B），這表明 PD-L2 的過表達(dá)增加了腫瘤細(xì)胞對(duì) TKI 的耐藥性。ZU 單次治療并未阻斷腫瘤生長（圖9B），這表明單獨(dú)靶向 PD-L2 不能逆轉(zhuǎn)厄洛替尼耐藥性。正如預(yù)期的那樣，陽性對(duì)照組 （Er + ADVshPD-L2） 在所有測試的模型中反應(yīng)最好（圖9B）。此外，ZU + 厄洛替尼組與陽性對(duì)照組相比沒有顯著差異，這表明 ZU 可以有效抑制 PD-L2，并且當(dāng)與厄洛替尼聯(lián)合使用時(shí)，可以顯著逆轉(zhuǎn)厄洛替尼耐藥性（圖9B）。此外，流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化結(jié)果顯示，聯(lián)合治療增加了腫瘤組織中浸潤白細(xì)胞（CD45+）的比例、T 細(xì)胞的活化 （CD3+CD69+）以及CD8+?T 細(xì)胞（CD8⁺GzmB+）的比例和功能（圖9C）。免疫組化顯示，聯(lián)合治療顯著抑制了增殖（圖9D）。為了全面評(píng)價(jià) EGFR-TKIs 聯(lián)合 ZU 的療效，作者建立了攜帶對(duì)奧希替尼耐藥的 LLC-EGFR19del?衍生腫瘤和對(duì)厄洛替尼耐藥的 CT26 EGFR19del?衍生腫瘤的同基因小鼠模型。小鼠接受生理鹽水（CTRL）、單獨(dú) EGFR-TKIs、 單獨(dú) ZU和EGFR-TKIs + ZU處理。作者的結(jié)果表明，與生理鹽水組相比，單獨(dú)使用 EGFR-TKIs 組或單獨(dú)使用 ZU 組小鼠的生存時(shí)間沒有顯著差異（圖9E， F）。然而，ZU 和 EGFR-TKIs（奧希替尼或厄洛替尼）的組合顯著延長了攜帶耐藥腫瘤的小鼠的生存期（圖9E，F(xiàn)）。這些結(jié)果表明，ZU 聯(lián)合 EGFR-TKIs 可以通過改善同基因小鼠模型中的腫瘤免疫環(huán)境來有效逆轉(zhuǎn)對(duì) EGFR-TKIs 的耐藥性。綜上所述，ZU 通過抑制 PD-L2 增強(qiáng) CD8+?T 細(xì)胞的功能，其與 EGFR-TKIs 的聯(lián)合作用可有效抑制耐藥腫瘤的增殖。

研究總結(jié)

在該研究中，由于難以獲得對(duì)?EGFR-TKIs?耐藥的臨床腫瘤樣本，作者使用轉(zhuǎn)染人?EGFR?突變體 （外顯子19?缺失） 的小鼠細(xì)胞系建立?EGFR-TKI?耐藥同基因小鼠模型約五個(gè)月，這是使用基因工程小鼠難以實(shí)現(xiàn)的。值得注意的是，該研究的?TKI?耐藥模型的關(guān)鍵點(diǎn)是將初始抑制率與不同傳代模型中的抑制率進(jìn)行了比較，例如?Os?治療的?LLC?從?44%?到?-12.3%，Er?治療的?CT26?從?55%?到?11.2%。因此，該研究認(rèn)為該模型可以反映臨床?TKI?給藥中的耐藥過程。這種方法使作者能夠研究?EGFR-TKIs?治療過程與腫瘤免疫環(huán)境之間的關(guān)系。作者的結(jié)果表明，EGFR-TKIs?對(duì)腫瘤免疫環(huán)境具有顯著而顯著的影響。當(dāng)?EGFR-TKIs?治療有效時(shí)，抗腫瘤免疫反應(yīng)增強(qiáng)。然而，當(dāng)發(fā)生耐藥性時(shí)，作者觀察到腫瘤浸潤白細(xì)胞的比例顯著降低，CD8+?T?細(xì)胞的比例和功能降低。不斷變化的腫瘤免疫環(huán)境可能是?PD-1?阻斷治療后立即再次用?EGFR-TKIs?攻擊對(duì)?EGFR-TKI?耐藥的?NSCLC?患者有效的原因 。此外，作者得出結(jié)論，抑制性腫瘤免疫環(huán)境是參與對(duì)?EGFR-TKIs?耐藥的機(jī)制之一。因此，作者從非遺傳角度揭示了?EGFR-TKIs 耐藥的新機(jī)制。