2024年2月，四川大學(xué)華西醫(yī)院在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊ANNALS?of Clinical and Translational Neurology發(fā)表一項(xiàng)重要研究成果，題為：Decoding the biology and clinical implication of neutrophils in intracranial aneurysm。使用單細(xì)胞 RNA 測(cè)序?(scRNA-seq)、RNA-seq 和小鼠模型來剖析在破裂和未破裂的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中性粒細(xì)胞的功能和臨床意義。

文章標(biāo)題：Decoding the biology and clinical implication of neutrophils in intracranial aneurysm

期刊名稱：ANNALS?of Clinical and Translational Neurology

合作單位：四川大學(xué)華西醫(yī)院

研究對(duì)象：顱內(nèi)動(dòng)脈瘤

研究方法：scRNA-seq、RNA-seq?數(shù)據(jù)挖掘、小鼠模型等

百邁客為該研究提供了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)。

研究背景

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤（IA）是一種常見的腦血管疾病，最終可導(dǎo)致毀滅性的出血性中風(fēng)。據(jù)估計(jì)，IA 的患病率為 3%-5%，由于人口老齡化和血管造影成像檢查的日益普及，這一數(shù)字正在增加。大多數(shù) IA 在整個(gè)生命周期中保持穩(wěn)定，而大約 1% 會(huì)進(jìn)展和破裂，導(dǎo)致致命的動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血，此種情況下超過一半的患者死亡和殘疾。不穩(wěn)定的 IA 的特征是動(dòng)脈瘤體積較大、形狀不規(guī)則，或者患者存在衰老、高血壓或吸煙等各類遺傳和環(huán)境高危因素。總體而言，目前對(duì)不穩(wěn)定 IA 發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制的理解還不夠充分，這強(qiáng)調(diào)了闡明 IA 壁的病理生理學(xué)改變和破裂相關(guān)的機(jī)制的重要性。

實(shí)驗(yàn)材料

對(duì)多個(gè)動(dòng)脈瘤臨床樣本和小鼠動(dòng)脈瘤模型樣本進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序。深度分析動(dòng)脈瘤數(shù)據(jù)集GSE13353和GSE122897。

1、scRNA-seq

在搭橋手術(shù)或夾閉術(shù)之前，從經(jīng)血管造影診斷為未破裂 IA 和動(dòng)脈瘤 SAH 的患者中收集沒有血栓的新鮮 IA 圓頂進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。任何懷疑患有導(dǎo)致血管動(dòng)脈瘤病變的遺傳性疾病的患者均被排除。并取小鼠 IA 模型的腦動(dòng)脈瘤組織進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。

2、Bulk RNA-seq

深度分析動(dòng)脈瘤數(shù)據(jù)集GSE13353和GSE122897。

研究結(jié)果

1.IA 組織中中性粒細(xì)胞的鑒定

根據(jù)之前明確的基因標(biāo)記，包括FCGR3B、CSF3R、CXCR2和G0S2，總共9025個(gè)中性粒細(xì)胞被人工分配（圖1A–C）。該研究進(jìn)一步使用 Azimuth 自動(dòng)注釋這些細(xì)胞，得到 8435 個(gè)中性粒細(xì)胞。IA1 是一種破裂的 IA 組織，與其他樣本相比，其中性粒細(xì)胞數(shù)量最多（圖1D）?？傮w而言，IA 破裂時(shí)中性粒細(xì)胞較多，這可能與 IA 破裂及隨后的局部血栓形成有關(guān)。值得注意的是，ssGSEA 分析顯示，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)生在 IA 破裂階段。根據(jù)中性粒細(xì)胞獨(dú)特表達(dá)的標(biāo)記基因，當(dāng) IA 破裂時(shí)，IA 形成和中性粒細(xì)胞數(shù)量增加（圖1E）?？傊@些結(jié)果強(qiáng)烈表明中性粒細(xì)胞參與 IA 進(jìn)展。

先前的研究表明中性粒細(xì)胞的功能和進(jìn)化具有異質(zhì)性，而IA穹隆中的中性粒細(xì)胞亞群仍然知之甚少。該研究使用“FindClusters”功能以更高分辨率（分辨率?=?0.9）重新聚類中性粒細(xì)胞，以識(shí)別不同的中性粒細(xì)胞群落。結(jié)果，鑒定出八個(gè)中性粒細(xì)胞亞群（C0-C7）（圖2A-B）。富集分析揭示了 C1 和 C6 中細(xì)胞凋亡途徑的正調(diào)節(jié)富集。具體而言，中性粒細(xì)胞胞外池?(NET) 的形成促進(jìn) IA 破裂，在 C1 中富集。對(duì)應(yīng)激反應(yīng)、脫顆粒和 NET 形成在 C8 中豐富，伴侶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)折疊和自噬在 C3 中豐富，表明這些細(xì)胞也受到應(yīng)激。TNF、NF-κB 和中性粒細(xì)胞脫粒等通路在 C0、C4、C5 和 C7 中富集，表明這些細(xì)胞執(zhí)行中性粒細(xì)胞的促炎功能。此外，還進(jìn)行了 RNA 速度分析來描繪中性粒細(xì)胞亞簇的潛在軌跡。結(jié)果，這些細(xì)胞形成了包含兩個(gè)分支的軌跡。C5 和 C6 亞簇可能是軌跡的末端，CR1、MEF2C?和?SYK?參與細(xì)胞凋亡（圖 2C）。

最近的研究根據(jù)中性粒細(xì)胞從骨髓到外周血的遷移決定了中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征，即“中性粒細(xì)胞”。該研究基于scRNA-Seq數(shù)據(jù)集研究了小鼠 IA 模型中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到IA組織時(shí)是否存在這種轉(zhuǎn)錄組特征。結(jié)果顯示假手術(shù)中存在少量中性粒細(xì)胞富集，并形成小鼠模型高表達(dá)的基因標(biāo)記，包括Ifitm6、Ltf、Camp?和?Chil3。這些細(xì)胞表達(dá)較低成熟或老化的基因標(biāo)記，如Malat1、Msrb1、Il1b和Ccl6（圖?3A），表明它們是從外周血新滲入的。執(zhí)行單片算法來識(shí)別細(xì)胞進(jìn)化軌跡，并將這些新滲透的細(xì)胞指定為起點(diǎn)（圖3B）。根據(jù)莫蘭斯指數(shù) (morans I) 以及未破裂（假手術(shù)）和破裂小鼠模型中的基因表達(dá)，該研究計(jì)算了 IA 組織中新浸潤(rùn)和老化中性粒細(xì)胞的基因特征（圖3C）。與之前的研究一致，新浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞高表達(dá)Cebpe，在粒細(xì)胞生成和炎癥因子產(chǎn)生中發(fā)揮作用，而相對(duì)老化的中性粒細(xì)胞表達(dá)S100a 家族基因和伴侶，如?Hspa1b、Has1a1?和?Hsp90aa1，表明壓力或衰老狀態(tài)。富集分析揭示了這些細(xì)胞的不同功能，新浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞中富集了多種代謝途徑，而老化的中性粒細(xì)胞則激活了炎癥和凋亡相關(guān)途徑（圖3D）?？傊?，這些結(jié)果表明 IA 組織中存在中性粒細(xì)胞，并強(qiáng)調(diào)了它們的功能異質(zhì)性。

2.募集中性粒細(xì)胞的細(xì)胞和細(xì)胞因子

在之前的研究中忽略了中性粒細(xì)胞向 IA 組織的局部募集，為了填補(bǔ)這一空白，使用 cellphoneDB 算法進(jìn)行了細(xì)胞間通信分析。該研究首先表征了未破裂 IA 組織中參與中性粒細(xì)胞募集的細(xì)胞和細(xì)胞因子。結(jié)果顯示血管細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、SMC 和周細(xì)胞）和免疫細(xì)胞（單核/巨噬/DC、中性粒細(xì)胞、T/B 淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞）廣泛產(chǎn)生中性粒細(xì)胞趨化因子（圖4A）。高頻趨化因子包括 CXCL2/3/1，它與 CXCR2/1 和 CCR1 等中性粒細(xì)胞受體結(jié)合（圖 4B）。在未破裂的 IA 中，主要參與中性粒細(xì)胞募集的細(xì)胞是單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，包括 Mono.1/2 和 Macro.1/2。在破裂的 IA 中招募中性粒細(xì)胞的趨化因子與未破裂的 IA 中的趨化因子表現(xiàn)出相似的模式組成，但對(duì) CXCL3 和 CCL5 的依賴性更高（圖 4C,D）。接收這些信號(hào)的中性粒細(xì)胞受體是保守的（圖4D）。

3.中性粒細(xì)胞與IA形成和破裂之間的關(guān)聯(lián)

為了研究中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的病理意義，該研究首先展示了破裂和未破裂樣本中每種類型的中性粒細(xì)胞的比例。破裂樣本中除 C6 之外的中性粒細(xì)胞亞群有所增加（圖5A）。該研究進(jìn)一步整理了這些中性粒細(xì)胞的基因特征，發(fā)現(xiàn)C0和C5在破裂的IA組織中顯著富集（圖5B，D）。此外，與正常血管組織相比，未破裂 IA 中的 C0 和 C5 也顯著富集，與 C4 和 C8 相同（圖5C），表明中性粒細(xì)胞參與 IA 形成和破裂。接下來，進(jìn)行 ROC 分析以評(píng)估中性粒細(xì)胞亞群與 IA 形成和破裂之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示C0和C6的ssGSEA評(píng)分在預(yù)測(cè)IA破裂方面產(chǎn)生了令人滿意的AUC值（兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的AUC?>?0.7）（圖5E），表明這些細(xì)胞可能參與IA破裂。反過來，C4 和 C5 在預(yù)測(cè) IA 形成方面表現(xiàn)良好。在此基礎(chǔ)上，C0 和 C5 的局部滲透分別是 IA 破裂和形成的有力預(yù)測(cè)因子。

4.IA穹隆中性粒細(xì)胞鐵死亡

中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥對(duì) IA 壁具有破壞性。最近，新出現(xiàn)的證據(jù)表明，中性粒細(xì)胞在某些情況下對(duì)鐵死亡敏感，這將進(jìn)一步促進(jìn)局部炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)并促進(jìn) IA 進(jìn)展。在此，該研究描述了 IA 中中性粒細(xì)胞與鐵死亡之間的潛在關(guān)聯(lián)。該研究根據(jù)兩個(gè)批量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集計(jì)算了 DEG，并注釋了鐵死亡驅(qū)動(dòng)基因和抑制基因（圖 6A,B）。結(jié)果顯示在破裂的 IA 組織中，幾個(gè)鐵死亡驅(qū)動(dòng)基因和抑制基因有顯著差異，表明鐵死亡途徑失調(diào)。破裂的 IA 組織的鐵死亡驅(qū)動(dòng)基因 ssGSEA 評(píng)分高于未破裂組織，而抑制基因的 ssGSEA 評(píng)分相當(dāng)（圖6C），表明鐵死亡與 IA 破裂之間存在關(guān)聯(lián)。值得注意的是，未破裂的 IA 組織的鐵死亡驅(qū)動(dòng)基因得分高于對(duì)照樣本，表明鐵死亡也可能參與 IA 的形成。多個(gè)基因與中性粒細(xì)胞鐵死亡有關(guān)，例如谷胱甘肽過氧化物酶 4(GPX4) 和微粒體谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶 1 (MGST1) 充當(dāng)鐵死亡抑制劑；花生四烯酸脂氧合酶 5(ALOX5)、花生四烯酸脂氧合酶 5 激活蛋白(ALOX5AP)、花生四烯酸脂氧合酶 12(ALOX12)、花生四烯酸脂氧合酶 15(ALOX15) 和前列腺素 2(PTGS2) 充當(dāng)鐵死亡驅(qū)動(dòng)程序。在單細(xì)胞分辨率下，中性粒細(xì)胞高表達(dá)PTGS2和ALOX5AP（圖6D），它們與鐵死亡顯著相關(guān)，表明這些細(xì)胞參與前列腺素和白三烯的產(chǎn)生，并且對(duì)鐵死亡敏感。盡管數(shù)量較少，但肥大細(xì)胞高度表達(dá) ALOX5 和 ALOX12。鑒于白三烯可以通過多細(xì)胞協(xié)同方式產(chǎn)生，局部白三烯可能是由中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞以協(xié)同方式產(chǎn)生的?？傊?，這些結(jié)果表明 IA 組織中中性粒細(xì)胞的鐵死亡可能是由 ALOX5AP 和 PTGS2 驅(qū)動(dòng)的，并且可以由肥大細(xì)胞促進(jìn)。

5.中性粒細(xì)胞NETosis

NET 的產(chǎn)生是中性粒細(xì)胞導(dǎo)致 IA 破裂的另一種方式，且取決于稱為 NETosis 的過程。因此，抑制 NETosis 是 IA 有前景的治療靶點(diǎn)。然而，由于這些細(xì)胞的多功能性，發(fā)生 NETosis 的中性粒細(xì)胞亞群尚不清楚。作者的結(jié)果表明 NETs 形成信號(hào)通路在 C1 中富集（圖2B）。該研究從京都基因和基因組百科全書 (KEGG) 數(shù)據(jù)庫中收集了人類 NETosis 基因特征，發(fā)現(xiàn) NETosis 的 ssGSEA 評(píng)分在 C1 中升高（圖7A）。PADI4?的表達(dá)對(duì)于組蛋白瓜氨酸化至關(guān)重要，在 C1 中上調(diào)，并表現(xiàn)出正相關(guān)的未剪接/剪接 mRNA 比率（圖 7B），表明PADI4在驅(qū)動(dòng)C1 NETosis中發(fā)揮作用。此外，PADI4的表達(dá)與C1中NETosis的ssGSEA評(píng)分成正比（圖7C），證實(shí)C1易于發(fā)生NETosis。與其他中性粒細(xì)胞相比該中性粒細(xì)胞子集專門表達(dá)?MNDA?(Pct.1?=?91.8%, Pct.2?=?54.5%),?CREB5?(Pct.1?=?74.7%, Pct.2?= 33.7%) 和?LRKK2?(Pct.1?=?78.4%, Pct.2?=?36.2%) ?(圖7D)，因此可以作為抑制 NETs 介導(dǎo)的 IA 進(jìn)展的目標(biāo)。

研究總結(jié)

該研究使用?scRNA-seq?對(duì)腦動(dòng)脈瘤臨床樣本和小鼠IA模型樣本進(jìn)行了測(cè)序。作者發(fā)現(xiàn)未破裂和破裂的?IA?穹頂都含有大量中性粒細(xì)胞，以表達(dá)FCGR3B、G0S2、CSF3R?和?CXCR2等基因?yàn)樘卣?。這些細(xì)胞在功能和分化方面表現(xiàn)出異質(zhì)性。盡管具有相似的基因表達(dá)譜，但I(xiàn)A穹頂中的中性粒細(xì)胞表達(dá)了一系列特征基因并與從骨髓到外周血遷移觀察到的轉(zhuǎn)錄組學(xué)改變相似。此外，未破裂的?IA?中中性粒細(xì)胞的募集主要由單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)，一旦破裂，中性粒細(xì)胞和炎癥平滑肌細(xì)胞 （SMC） 的特定亞群都參與該過程。ROC分析表明，不同的中性粒細(xì)胞亞簇分別與IA的形成和破裂相關(guān)。通過回顧目前的研究，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞通過特異配體、ALOX5AP?和?PTGS2?驅(qū)動(dòng)的鐵死亡，以及?PADI4?介導(dǎo)的NETosis對(duì)?IA 壁完整性起著不利作用。