2023年1月17日，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所等多個單位研究成果“De?novo?genome assembly and analyses of?12 founder inbred lines provide insights into maize heterosis”在線刊登國際知名期刊Nature Genetics！該研究完成了12個玉米基因組的構(gòu)建，并通過泛基因組、eQTL等手段解析了玉米的雜種優(yōu)勢機制，為加速玉米改良育種提供了重要理論基礎(chǔ)和遺傳資源。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所研究員王寶寶、博士研究生候美、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)已畢業(yè)博士史俊鵬（現(xiàn)為中山大學(xué)副教授）、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)教授庫麗霞、北京市農(nóng)林科學(xué)院研究員宋偉及中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作科所副研究員李春輝為論文共同第一作者，通訊作者為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)王海洋教授、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)賴錦盛教授、北京市農(nóng)林科學(xué)院趙久然研究員和河南農(nóng)業(yè)大學(xué)陳彥惠教授。百邁客以共同作者參與本項研究。

研究背景

雜種優(yōu)勢是指兩個遺傳組成不同的親本雜交產(chǎn)生的雜種F₁，在產(chǎn)量、生物量和抗逆性等方面表現(xiàn)優(yōu)于親本的現(xiàn)象。玉米約占全球谷物總產(chǎn)量的36%，中國和美國是世界兩大玉米主產(chǎn)國，生產(chǎn)量占全球約60%。玉米也因其異交習(xí)性、豐富的遺傳變異和農(nóng)業(yè)重要性而成為雜種優(yōu)勢研究的模式植物。前期研究致力于剖析玉米雜種優(yōu)勢的機制，包括繪制不同雜交組合中不同農(nóng)藝性狀的雜種優(yōu)勢位點，分析基因表達(dá)、基因組分化、表觀遺傳調(diào)控和親本及其雜交后代中的代謝產(chǎn)物等。然而雜種優(yōu)勢的分子機制仍不清楚，限制雜種優(yōu)勢研究的一個主要因素是缺乏有關(guān)親本的高質(zhì)量參考基因組及其遺傳變異的準(zhǔn)確信息。

材料方法

Denovo

材料：

①被廣泛用于溫帶玉米育種的11個骨干自交系（FIL）：A632（代表SS2組）、Ye478和Zheng58（代表中國PA組）、OH43（代表Lancaster 2組），PH207（代表IDT組）、Xu178（代表PB組）、Jing724（代表X組）、Huangzaosi、Chang7-2和Jing92（代表TSPT組）。Dan340源自中國陸地種族LvDa Red Cob（LRC）。

②代表亞熱帶群的FIL材料S37。

③B73（代表SS1組）、Mo17（代表Lancaster 1組，前期研究）

平臺：Illumina（平均深度~94.35×）、PacBio（平均深度~55.3×）、BioNano（平均深度~139.9×）

RNA-seq

131個自交系吐絲期的幼穗（6G）

QTL及GWAS分析

①350個溫帶優(yōu)良自交系；

②670個Xu178×HuangC雜交的RIL群體;

③14個FILs雙列雜交的91個F_1S組合。

主要研究結(jié)果

1、12個骨干自交系的親緣關(guān)系及基因組組裝注釋

為了研究玉米雜種優(yōu)勢群形成的遺傳基礎(chǔ)并探索玉米雜種優(yōu)勢的分子機制，作者重新分析了在美國和中國廣泛用于現(xiàn)代玉米育種的350個優(yōu)良自交系（IL）的群體結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，這些材料可分為10個亞組，分別對應(yīng)于SS（SS1、SS2）、NSS（Lancaster1、Lancaster 2）、IDT、PA、TSPT、PB組、X組和混合組（圖1）。并基于系統(tǒng)發(fā)育樹，選擇了12個骨干自交系（FIL）用于高質(zhì)量的基因組組裝和注釋。這些自交系中，每一個FIL都曾被用來培育幾十或數(shù)百個不同雜種群體的優(yōu)良親本系，并在現(xiàn)代雜交玉米育種中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，具有廣泛的代表性。

圖1?現(xiàn)代玉米育種中典型玉米自交系的群體結(jié)構(gòu)分析

通過三代組裝，12個材料組裝大小在2.18 Gb~2.31 Gb；Contig N50（0.27 Mb-2.07 Mb）、Scaffold N50（4.36 Mb-15.34 Mb）、染色體掛載率94.3%-97.6%（表1），平均預(yù)測了44,554個蛋白質(zhì)編碼基因（42,111~46,320個）。通過二代reads評估（平均~99.26%）、BUSCO評估（基因組平均~96%；基因平均~97.2%）、LAI評估（平均~27.16）等結(jié)果顯示，本次構(gòu)建了高質(zhì)量和高完整性的玉米基因組。

表1 14個玉米材料基因組結(jié)果統(tǒng)計

重復(fù)元件是玉米基因組的主要組成部分，在調(diào)節(jié)基因組進(jìn)化和適應(yīng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。所有12個FIL顯示出高度相似的轉(zhuǎn)座元件（TEs）組成，占整個基因組~83.94-85.56%。在反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中，Gypsy（37.51-41.44%）和Copia（16.36-19.81%）超家族較豐富。Gypsy在著絲粒周圍區(qū)域富集與基因分布呈負(fù)相關(guān)。而Copia在染色體臂富集，Helitron轉(zhuǎn)座子的分布與Copia相似，并在著絲粒周圍區(qū)域大量減少。Copia和Helitron與基因分布呈正相關(guān)。Helitron?TEs位于接近基因的位置，尤其是外顯子中，表明了Helitron-like轉(zhuǎn)座子有助于基因復(fù)制、外顯子重排，從而導(dǎo)致基因組進(jìn)化和多樣化。超過50%的DTT TEs和DTH TE位于基因附近（約2kb區(qū)域）。平均20.1%的DNA/DTH、23.1%的DNA/DTT TEs、16.8%的MITE/DTH TE和32.5%的MITE/DTT TE位于gene body中。平均4.7%的DNA/DTH、4.4%的DNA-DTT TEs、3.4%的MITE/DTH TE和3.1%的MITE/DTT TE在外顯子區(qū)。平均3.4%的DNA/DTA和2.2%的MITEs/DTA TE位于外顯子中，比DTH和DTT TE的頻率低。這些結(jié)果表明，不同的TEs具有不同的分布和換位模式特征，它們的活動共同促成了玉米基因組的進(jìn)化和多樣化。

2、14個玉米骨干自交系泛基因組構(gòu)建

通過14個玉米泛基因組構(gòu)建，將在所有玉米中都檢測到的基因被定義為核心基因家族（core ；18525個，42.57%），在12~13份玉米中檢測到的被定義為軟核心基因家族（softcore；9976個，22.92%），在2~11份中檢測到的被定義為可變基因家族（dispensable；14992個，34.45%），只有一份中檢測到的被定義為特有基因家族（private；25個，0.06%）。

通過模擬分析發(fā)現(xiàn)，總基因集隨著基因組的增加而增加，當(dāng)n＝12時接近穩(wěn)定（圖2a），表明這14個玉米足夠具有代表性。核心基因的百分比隨著玉米數(shù)量的增加而下降，但即使當(dāng)n=14時也沒有穩(wěn)定下來，表明玉米擁有大量的非共享基因。

隨后，作者使用RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究了不同pan-gene的表達(dá)譜?？傮w表達(dá)豐度情況從核心、軟核心到可變基因逐漸降低，表明核心基因具有穩(wěn)定和更廣泛的表達(dá)譜，而可變基因具有較低水平、組織特異性、品系特異性或條件依賴性表達(dá)。核心基因編碼區(qū)中非同義變與總突變的比率低于軟核心和可變基因（圖2f）?？梢宰⑨尩幕虮壤龔暮诵?、軟核心到可變基因逐漸減少（圖2g）。以上結(jié)果表明，核心基因在進(jìn)化上更加保守。

圖2 14份玉米泛基因組分析

3、14個FILs基因組的共線性分析和遺傳變異研究

接下來對14個FILs基因組進(jìn)行成對的共線性分析和遺傳變異研究，發(fā)現(xiàn)14個基因組之間平均共享56.31%的one-to-one共線性塊。將13個FILs的所有one-to-one共線性塊與B73_v4比對，發(fā)現(xiàn)這些FILs中存在廣泛的遺傳變異；并在保守區(qū)域發(fā)現(xiàn)了幾個與玉米馴化或傳播相關(guān)的基因，包括TGA1、TB1和ZmCCT10。此外，該分析也為雜種優(yōu)勢群的形成提供了參考。研究發(fā)現(xiàn)，亞熱帶FIL S37與13個溫帶FILs的共線性和IBS均低，溫帶FILs間的共線性較高（圖3a）。值得注意的是，三種TSPT型FILs與其他FILs的共線性較低，說明其具有獨特的基因組組成和特征（圖3a）。揭示了TSPT類群與其他類群(特別是PA-和X-品系)可以形成優(yōu)良的雜種優(yōu)勢模式的潛在機理。

對14個FILs基因組成對比對分析，在共線性區(qū)域，平均檢測到8,489,166個SNPs、1,223,484個small InDels (< 50bp)和37,459個SVs（50bp-10kb）（圖3b）。并且，本研究開發(fā)了一種方法用來鑒定13個FILs和B73之間的大片段SVs(大于100 kb)，平均檢測到337個大片段SVs，其中有12個的SVs大于1 Mb，包含先前報道的存在于B73和Mo17間的2.9 Mb的SV，含有玉米甘蔗花葉病毒(SCMV)抗性基因ZmTrxh。

另外，該研究也在14個FILs中鑒定了PAVs，平均鑒定到16,152個PAVs和184個PAV基因（圖3b）。GO富集分析表明，PAV基因在防御反應(yīng)、DNA整合、蛋白質(zhì)磷酸化、萜類生物合成過程、激素介導(dǎo)的信號通路、細(xì)胞氧化解毒等生物過程中富集。將19個野生近緣種和23個地方種的重測序數(shù)據(jù)與14個FILs基因組進(jìn)行比對，在至少一份大芻草或地方種質(zhì)中，平均檢測到93.4%的FIL特異性序列的密切相關(guān)同源物，與之前的報道一致，這些PAVs中的大多數(shù)都是來源于玉米祖先種中存在的變異。

14個FILs的共線性基因中，1,964個在基因內(nèi)部(外顯子和內(nèi)含子)沒有出現(xiàn)任何遺傳變異，歸類為結(jié)構(gòu)保守基因。GO富集分析表明，保守基因富集的生物過程主要與植物的基本生命過程有關(guān)，如端粒組織或維持、DNA結(jié)構(gòu)改變、重組、代謝與修復(fù)、染色體組織、細(xì)胞器組織等。值得注意的是，平均有7,390個共線性基因具有較大效應(yīng)突變，如起始密碼子或終止密碼子突變、剪接供體或剪接受體突變、移碼突變或過早終止密碼子突變，表明這些FILs共線性基因之間的仍具有較大的遺傳多樣性。

圖3 14個FILs基因組的比較分析

4、SVs對不同雜種優(yōu)勢群的表型貢獻(xiàn)

據(jù)報道，ZmCCT10、ZmCCT9、VGT1和ZCN8幾個基因的自然變異是玉米從熱帶地區(qū)向溫帶地區(qū)傳播的重要驅(qū)動力。350份溫帶ILs的PCR基因分型分析發(fā)現(xiàn)，早花型單倍型在ZmCCT9、VGT1和ZCN8上的累積效應(yīng)與這些雜種優(yōu)勢群的開花表型一致。因此，ZmCCT9、VGT1和ZCN8對溫帶玉米雜種優(yōu)勢群的開花時間分化有一定的貢獻(xiàn)，在未來的溫帶玉米育種中，這3個基因可作為提高PA、TSPT、PB品系開花期改良的位點。

玉米穗行數(shù)(KRN)是影響玉米產(chǎn)量的重要因素。先前的研究已經(jīng)報道了位于UB3下游約60 kb的一個1.2 kb的轉(zhuǎn)座子片段的插入，是一個主效的 QTL KRN4的重要功能變異。本研究發(fā)現(xiàn)SS 品系具有高KRN的有利單倍型，揭示1.2kb轉(zhuǎn)座子插入可能是SS品系中更高KRN的重要原因。之前研究發(fā)現(xiàn)，一個編碼絲氨酸蘇氨酸類受體蛋白激酶的基因KNR6，可以調(diào)控玉米產(chǎn)量。本研究證實穗長(EL)和行粒數(shù)(KNR)與KNR6 5′-UTR區(qū)域一個Harbinger-like轉(zhuǎn)座子插入引起的兩種單倍型顯著相關(guān)。350份溫帶ILs的PCR基因分型表明該SV可能是NSS和TSPT品系EL和KNR差異的主要原因。

利用Xu178（抗玉米粗縮病,MRDD）和HuangC的RILs群體進(jìn)行玉米粗縮?。∕RDD）抗性QTL定位，在8號染色體上檢測到一個主效QTL。并且發(fā)現(xiàn)在14個FILs中，只有Xu178在抗性基因ZmGDIα中存在功能獲得突變(由Helitron轉(zhuǎn)座子插入引起)。進(jìn)一步分析表明Helitron轉(zhuǎn)座子是Xu178抗MRDD的重要原因。此外，分析表明Mo17和OH43的第6號染色體均含有約2.9Mb的大片段SV，可能是Mo17和OH43對SCMV易感性的基礎(chǔ)。350個溫帶ILs的PCR基因分型進(jìn)一步表明大片段SV是區(qū)分不同抗病性品系的主要位點。

5、eQTL研究確定基因表達(dá)變異和農(nóng)藝性狀相關(guān)的SVs

SVs通常影響基因的表達(dá)，本研究對350個溫帶ILs中的131個ILs的幼穗進(jìn)行RNA-seq測序。通過eQTL分析，共鑒定出306,868個近端eQTL位點。ZmLOX3是引起玉米莖腐病和穗腐病的真菌病原菌鐮孢菌(Fusarium verticillioides)的主要感病因子，是抗病性的負(fù)調(diào)控因子。作者選擇一個與ZmLOX3相鄰的eQTL進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)了兩個SV變異（SV151和SV363），均與ZmLOX3的表達(dá)顯著相關(guān)。基于SV151和SV363，鑒定出ZmLOX3的4種單倍型(Hap-0/0, Hap-0/363, Hap-151/0和Hap-151/363)，Hap-0/363為有利單倍型，Hap-151/0為不利單倍型，為未來育種中利用這些SVs提高穗腐病抗性提供了潛在的新靶點。

eQTL分析還檢測到兩個近端eQTL，分別與Zm00001d006055和Zm00001d011140的表達(dá)水平相關(guān) (圖4a和5a)。Zm00001d006055的同源基因調(diào)控花的形態(tài)發(fā)生，Zm00001d011140的同源基因在調(diào)節(jié)植物發(fā)育中發(fā)揮重要作用。350個溫帶ILs的基因分型顯示，Zm00001d006055(圖4a-4c)的6 bp InDels和Zm00001d011140(圖5a-5c)的92 bp SVs位于已報道的染色體開放區(qū)域(OCRs)，與各自的表達(dá)變異顯著相關(guān)。此外，田間試驗表明，與野生型相比，功能缺失突變體Zm00001d006055(圖4d-4f)和Zm00001d011140(圖5d- 5f)較其野生型材料分別表現(xiàn)為雄穗分枝顯著減少和穗位高顯著降低的表型。上述結(jié)果表明，Zm00001d006055和Zm00001d011140分別對雄穗分枝數(shù)和穗位高有正向調(diào)控作用。等位基因頻率分析顯示，PA品系中含有6 bp InDel的單倍型的頻率(21.1%)遠(yuǎn)高于TSPT品系(4.3%)，NSS品系中含有92 bp的單倍型的頻率(31.1%)遠(yuǎn)高于TSPT品系(4.3%)(圖4g和5g)，可能是這些亞群間對應(yīng)性狀分化的重要原因。

圖4 Zm00001d006055的功能驗證

圖5?Zm00001d011140的功能驗證

6、雜種優(yōu)勢與基因組變異的相關(guān)性

為了研究玉米非核心基因組變異與雜種優(yōu)勢之間的關(guān)系，作者得到了14個FILs雙列雜交的91個F_1S，并收集了3個不同環(huán)境下的產(chǎn)量數(shù)據(jù)。表型分析表明，以單株產(chǎn)量(GYPP)計算，所有F₁雜種均表現(xiàn)出超過雙親平均值的中親優(yōu)勢(MPH)和超過較好親本的超親優(yōu)勢(BPH)（圖5a）。

之前研究報道了雜種優(yōu)勢與分子遺傳距離（GD）存在弱正相關(guān)關(guān)系。本研究為了研究產(chǎn)量雜種優(yōu)勢與遺傳變異之間的關(guān)系，首先將基因組劃分為共線性和和非共線性區(qū)域。相關(guān)分析顯示，共線性區(qū)域長度與GYPP的BPH呈顯著負(fù)相關(guān)(圖5b)。共線性區(qū)域的SNPs和small InDels僅與GYPP的BPH呈弱相關(guān) (圖5c和5d)。相反，非共線性區(qū)域長度、SV_Number和PAV_Number均與GYPP的BPH呈顯著正相關(guān)（圖5e-g）。其中，SV_Number與GYPP雜種優(yōu)勢表現(xiàn)出強的相關(guān)性（圖5f）。SVs可以進(jìn)一步分為插入或缺失、串聯(lián)收縮擴(kuò)張和重復(fù)收縮擴(kuò)張。其中，插入缺失與GYPP雜種優(yōu)勢的相關(guān)性強。綜上所述，表明SVs的數(shù)量對GYPP的貢獻(xiàn)很顯著，支持了SVs在雜種優(yōu)勢中起主導(dǎo)作用這一觀點。

圖6 91個雙列雜交F1S親本雜種優(yōu)勢與不同類型遺傳變異的相關(guān)性分析

7、ZmACO2和ZAR1中的SVs有助于雜種優(yōu)勢的形成

近期研究報道的乙烯生物合成關(guān)鍵基因ZmACO2，為穗長和籽粒產(chǎn)量主效QTL KNPR6的功能基因。前期研究對214個不同自交系的重測序分析和候選GWAS分析確定了5個與穗長顯著相關(guān)的多態(tài)性變異，這些變異處于高度連鎖不平衡狀態(tài)。這五個多態(tài)性位點形成了兩種不同的單倍型：Hap-SL17和Hap-Ye478。與攜帶Hap-SL17的自交系相比，攜帶Hap-Ye478的自交系穗長和行粒數(shù)更多，并且在攜帶Hap-Ye478的自交系中ZmACO2的表達(dá)顯著低于Hap-SL17的自交系。

為了評價這些遺傳變異對雜種優(yōu)勢的影響，作者對14個FILs進(jìn)行了單倍型分析，除了Hap-SL17和Hap-Ye478之外，還得到一種新的單倍型(命名為Hap-Jing92)（圖6a）。具有Hap-Ye478/Hap-SL17或Hap-Ye478/Hap-Jing92雜合單倍型的F₁雜種的GYPP_MPH和GYPP_BPH的均值均顯著高于各自純合單倍型的成對親本(MPP)的平均值（圖6b-d）。這些結(jié)果支持ZmACO2可能以超顯性方式促進(jìn)雜種優(yōu)勢的產(chǎn)生。為了進(jìn)一步驗證ZmACO2在雜種優(yōu)勢中的作用，將兩個近等基因系NIL-Ye478和NIL-SL17組合成F₁雜交，并將其產(chǎn)量與兩個親本進(jìn)行比較。結(jié)果表明，F(xiàn)₁雜種的穗長、行粒數(shù)和產(chǎn)量均顯著高于親本NILs，驗證了ZmACO2在調(diào)節(jié)雜種優(yōu)勢方面的超顯性效應(yīng)(圖6e-6g)。

之前的一項研究報道，玉米ARGOS1(ZAR1)轉(zhuǎn)基因過表達(dá)后可提高玉米生長量、子粒產(chǎn)量和抗旱性。分析表明ZAR1是一個雜種優(yōu)勢基因，同樣可能以超顯性方式促進(jìn)雜種優(yōu)勢。為了進(jìn)一步研究ZAR1單倍型對產(chǎn)量雜種優(yōu)勢的影響，對14個FILs中ZAR1的單倍型分析發(fā)現(xiàn)，除了先前報道的Hap NSS和Hap SS外，還有一種TSPT品系特有的第三種單倍型（將其命名為Hap TSPT）（圖6h）。具有雜合單倍型(Hap-NSS/Hap-TSPT或Hap-SS/Hap-TSPT)的F₁雜種的平均GYPP、GYPP_MPH、GYPP_BPH均顯著高于各自純合單倍型的親本的平均值。但是具有Hap-NSS/Hap-SS雜合單倍型的F₁雜種的GYPP、GYPP_MPH、GYPP_BPH的均值與其兩個純合單倍型的MPP均值沒有顯著差異（圖6i-k）。這種不一致性可能是由于ZAR1單倍型的復(fù)雜環(huán)境互作造成的?？傊?，前期研究和本研究的結(jié)果強烈表明ZAR1以超顯性方式促進(jìn)雜種優(yōu)勢，其啟動子和編碼區(qū)域的自然變異有助于雜種優(yōu)勢的產(chǎn)生。

圖7?ZmACO2和ZAR1的自然變異有助于雜種優(yōu)勢的形成

總 結(jié)

本次研究完成了12個核心玉米骨干自交系基因組組裝并結(jié)合已公布B73、Mo17基因組構(gòu)建了玉米泛基因組。通過基因組比對與變異檢測并結(jié)合eQTL定位和關(guān)聯(lián)研究，揭示了玉米基因組結(jié)構(gòu)變異與雜種優(yōu)勢群的分化和性狀調(diào)控密切相關(guān)。發(fā)現(xiàn)玉米雜種優(yōu)勢與父母本基因組的非線性區(qū)段及存在的結(jié)構(gòu)變異呈顯著正相關(guān)。鑒定了兩個玉米雜種優(yōu)勢關(guān)鍵基因（ZAR1和ZmACO2），證明了Complementation和over-dominance都參與玉米雜種優(yōu)勢。本研究結(jié)果促進(jìn)了對不同玉米雜種優(yōu)勢類群的基因組和表型分化的遺傳基礎(chǔ)的理解，為闡明玉米雜種優(yōu)勢機理邁出了堅實的一步，為玉米的全基因組選擇育種研究提供了有力支撐。

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