導(dǎo)讀

由北京百邁客生物科技有限公司與中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所合作的研究論文《Comparative full-length transcriptome analysis provides novel insights into the regulatory mechanism of natural rubber biosynthesis in Taraxacum kok-saghyz Rodin roots 》與今年11月在官網(wǎng)在線發(fā)表。該文運(yùn)用Nanopore三代測序技術(shù)為橡膠草中天然橡膠生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新的見解。該文充分體現(xiàn)了ONT全長轉(zhuǎn)錄組可同時(shí)對基因和轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量，定性定量準(zhǔn)確性高的優(yōu)勢?；谏弦淮蔚奈恼隆蹲鯫NT全長轉(zhuǎn)錄組，一定要找百邁客》，這一次小編帶大家溫故知新，深入了解ONT全長轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用。

英文題目：Comparative full-length transcriptome analysis provides novel insights into the regulatory mechanism of natural rubber biosynthesis in Taraxacum kok-saghyz Rodin roots

中文題目：橡膠草根全長比較轉(zhuǎn)錄組為天然橡膠生物合成的調(diào)控機(jī)制提供了新的見解

發(fā)表期刊：Industrial Crops & Products

影響因子：5.645

研究背景

橡膠草（Taraxacum kok-saghyz，TKS）是一種小型、二倍體、有性生殖、蓮座狀多年生植物。它屬于菊科植物，起源于中國和哈薩克斯坦的天山山區(qū)。TKS的根部可以產(chǎn)生大量的天然橡膠（Natural rubber，NR）（高達(dá)20%干重），其分子量與巴西橡膠樹相似。TKS具有種植面積廣、NR含量和質(zhì)量高、易于種植和收獲、成熟時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，因此TKS是一種具有商業(yè)前景的優(yōu)質(zhì)NR替代源。然而，高雜合度和自交不親和導(dǎo)致的近交衰退是將TKS培育成NR生產(chǎn)作物的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。更好地理解NR生物合成途徑和相關(guān)基因，以及TKS中相互競爭的代謝途徑，將有助于選擇合適的經(jīng)典或生物技術(shù)育種策略來改善TKS培育。迄今為止，許多與NR生物合成相關(guān)的基因已在TKS和其他NR生產(chǎn)植物中被鑒定。TKS基因組組裝于2017年構(gòu)建，鑒定出40個(gè)屬于MVA途徑的基因、19個(gè)參與起始劑合成的基因和20個(gè)參與NR合成的基因。然而，關(guān)于TKS中NR生物合成的分子機(jī)制的知識仍然是不完整和難以捉摸的。

更好地理解TK中NR的生物合成，包括識別限速酶和競爭代謝途徑，對于定義經(jīng)典育種策略和生物技術(shù)育種策略是必要的。最近發(fā)現(xiàn)，使用SMRT測序可以獲得全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。然而，這項(xiàng)技術(shù)尚未應(yīng)用于TKS，這大大限制了我們對TKS轉(zhuǎn)錄組的了解，尤其是對NR生物合成相關(guān)基因的了解。在本研究中，采用ONT測序技術(shù)獲得TKS根的全長轉(zhuǎn)錄組，并對具有不同NR含量的TKS組進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，以探索哪些代謝途徑或基因在轉(zhuǎn)錄水平上影響或參與NR的合成、調(diào)節(jié)和積累。這項(xiàng)工作將有助于進(jìn)一步了解NR生物合成的分子機(jī)制，這對于提高TKS的培養(yǎng)效率至關(guān)重要。

實(shí)驗(yàn)材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料：野生TKS種群（來自中國新疆天山山區(qū)），并將其種植在中國?？谙鹉z研究所的種質(zhì)苗圃中。

實(shí)驗(yàn)方法：測定野生種群中TKS植物的干橡膠含量，從野生TKS群體中選擇橡膠含量最高的三個(gè)植物（LR-1:2.09%，LR-2:3.09%和LR-3:3.27%）和橡膠含量最高的三個(gè)植物（HR-1:9.21%，HR-2:8.92%和HR-3:9.06%）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。利用TKS的自交不親和性，構(gòu)建了6個(gè)TKS組，并進(jìn)行了組織培養(yǎng)繁殖。培養(yǎng)物在25?C溫室中培養(yǎng)，且有16小時(shí)的光照/8小時(shí)的暗光周期（光強(qiáng)度約為13000 LUX）。對

每個(gè)品組，總共收集1g組織培養(yǎng)幼苗（4個(gè)月齡）的新鮮根，清潔并冷凍。

測序策略：PromethION 平臺，共構(gòu)建6個(gè)cDNA文庫。

主要研究結(jié)果與分析

1、全長轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)總體概述

六個(gè)樣本的平均全長嵌合序列FLNC讀取率達(dá)到80.68%，平均獲得20360個(gè)非冗余轉(zhuǎn)錄本，平均N50長度和平均長度分別為1607bp和1378bp（表 1），這比之前獲得的根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)要好。LR和HR組的平均AS事件分別為1408和1605?？勺兗羟蟹治鼋Y(jié)果顯示最常見的剪接類型是內(nèi)含子保留，LR組占45.41%，在HR組占有46.29%（圖1 A）。互斥外顯子最不常見，在LR和HR轉(zhuǎn)錄組中分別為0.86%和1.04%。APA分析顯示具有一個(gè)多聚（A）位點(diǎn)的基因數(shù)量最高，LR和HR組的平均基因數(shù)分別為3896和3733，具有五個(gè)多聚（A）位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量最低，分別為1242和1386（圖1B）。文中共對54135個(gè)序列（77606351bp）進(jìn)行了SSR分析，包括16354個(gè)SSR序列和12855個(gè)含有SSR的序列。此外，單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的數(shù)量分別為5522、4258、6139、176、44和215。其中，三核苷酸SSR的密度最高，為68（圖1C）。

圖1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2、EDGs的KEGG通路分析

在HR與LR的比較中確定了3134個(gè)DEG；其中，1157個(gè)DEG上調(diào)，1977個(gè)DEG下調(diào)（圖2）。對HR和LR中的DEG進(jìn)行KEGG途徑富集分析，以揭示代謝機(jī)制中的DEG（圖3）。發(fā)現(xiàn)次級代謝產(chǎn)物生物合成途徑（苯丙烷生物合成、倍半萜和三萜生物合成）顯著富集，并且這些途徑中的大多數(shù)DEG在HR組中被下調(diào)。相反，在HR組中，參與NR生物合成、光合作用和過氧化物酶體途徑的DEG普遍上調(diào)。

在次級代謝富集途徑中，苯丙烷生物合成產(chǎn)生大量次級代謝產(chǎn)物，如二苯乙烯類、二芳基庚烷類、姜辣素、類黃酮等。在HR和LR中，苯丙烷生物合成途徑中鑒定出39個(gè)DEG（圖4A）。在這些DEG中，三個(gè)編碼苯丙氨酸解氨酶的基因在HR組中被下調(diào)，它們催化苯丙烷生物合成的第一步。同樣，三個(gè)編碼反式肉桂酸4-單加氧酶的基因和一個(gè)編碼咖啡酰輔酶A O-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因被下調(diào)。結(jié)果表明，需要乙酰輔酶A參與的苯丙烷和許多其他次級代謝產(chǎn)物（二芳基庚烷、姜辣素和黃酮）的合成在HR系中減少。在倍半萜和三萜生物合成途徑中確定的四個(gè)DEG中，HR組中有三個(gè)基因下調(diào)（圖4B），其中，編碼鯊烯合酶的基因是最顯著的下調(diào)基因。結(jié)果表明，HR品系中這些次生代謝物的合成少于LR品系中的合成，表明當(dāng)IPP用作前體時(shí)，NR與諸如五環(huán)三萜和甾醇等次生代謝物之間存在競爭。

在光合作用途徑中，共鑒定出24個(gè)DEG，其中21個(gè)在HR組中上調(diào)（圖4C）。相反，在糖酵解的26個(gè)DGE和檸檬酸循環(huán)的12個(gè)DGE中，分別有22個(gè)和9個(gè)基因下調(diào)（圖4D和E）。此外，檸檬酸循環(huán)中的幾個(gè)關(guān)鍵基因，例如編碼烏頭酸水合酶、異檸檬酸脫氫酶和琥珀酰輔酶A合成酶的基因在HR組中下調(diào)。過氧化物酶體是主要參與脂肪酸β-氧化和光呼吸等氧化代謝反應(yīng)的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器。在過氧化物酶體途徑中鑒定出19個(gè)DEG，在HR和LR中有12個(gè)下調(diào)基因和7個(gè)上調(diào)基因（圖4F）。在這些基因中，一個(gè)編碼過氧化物酶體生物發(fā)生蛋白5的過氧化物酶體生物發(fā)生基因和一個(gè)編碼過氧化物酶體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸載體的基因在HR組中上調(diào)，后者對脂質(zhì)降解至關(guān)重要。結(jié)果表明，在HR株系中可以獲得額外的脂源乙酰輔酶A，并且可以用于NR的生物合成。

在脂肪酸代謝中，包括亞油酸、α-亞麻酸和花生四烯酸代謝，共鑒定出27個(gè)DEG；其中，24個(gè)基因在HR組中下調(diào)，包括兩個(gè)編碼棕櫚酰蛋白硫酯酶的基因、一個(gè)編碼長鏈?；o酶A合成酶的基因和一個(gè)編碼三酰甘油脂肪酶SDP1的基因，參與亞油酸、α-亞麻酸和花生四烯酸的合成（圖4H）。酮體是葡萄糖的重要替代能源，一個(gè)編碼羥甲基戊二酰輔酶A裂解酶的基因是催化酮生成的關(guān)鍵步驟，在HR組中被下調(diào)（圖4H）。

在植物激素啟動(dòng)的信號途徑中，共鑒定出24個(gè)DEG，其中19個(gè)基因在HR組中下調(diào)，包括兩個(gè)BAK1基因，它們介導(dǎo)油菜素類固醇（BR）信號（圖4I）。此外，參與抗病性的NPR1/NIM1樣基因和3個(gè)參與茉莉酸反應(yīng)的TIFY基因在HR株組中也被下調(diào)。在植物-病原體相互作用途徑中，共鑒定出23個(gè)DEG，HR株組中有20個(gè)基因被下調(diào)，包括植物激素啟動(dòng)的信號途徑中的BAK1（圖4J）。

圖2,3,4差異基因鑒定與KEGG分析

注：A：苯丙烷生物合成；B：倍半萜和三萜生物合成；C:光合作用；D:糖酵解糖異生；E：檸檬酸循環(huán)；F：過氧化物酶體；G：谷胱甘肽代謝；H：脂肪酸和酮代謝；I：植物激素啟動(dòng)；J:植物-病原相互作用。

3、NR生物合成相關(guān)基因的表達(dá)分析

焦磷酸異戊烯基（IPP）作為NR的基本組成部分，通過胞質(zhì)甲戊酸（MVA）途徑或質(zhì)體MEP途徑形成。在MVA途徑中，鑒定出七種ACAT，它們催化MVA途徑的第一步。其中，ACAT3、ACAT4、ACAT5和ACAT7在高表達(dá)水平的HR組中下調(diào)，而ACAT2、ACAT6和ACAT8在低表達(dá)水平下略微上調(diào)（圖5）。共鑒定出12個(gè)HMGR，其中9個(gè)HMGR在HR組中不同程度下調(diào)，尤其是HMGR3，其在HMGRs中的表達(dá)水平最高。MVA途徑中的其余基因，如MVAK和PK、HMGS和MVD，具有相似的表達(dá)模式，它們在HR和LR中的差異表達(dá)水平不顯著（圖5）。結(jié)果說明MVA途徑是TKS根部NR生物合成的IPP的主要來源。

在起始劑合成途徑中，IPP用作起始劑來合成聚丙烯基二磷酸。在本研究中，編碼異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶（IPI）、香葉基二磷酸合酶（GGPS）、香葉基二磷酸合酶（GPS）和法尼基二磷酸合酶的19個(gè)基因中沒有DEGs （FPS）在HR和LR中（圖5），表明引發(fā)劑合成可能不是TKS中NR合成的限制因素。
在NR合成途徑中，CPT是NR在橡膠顆粒上伸長的關(guān)鍵基因。總共確定了六個(gè)CPT，其中，表達(dá)最高的CPT1在HR組中顯著上調(diào)（圖5）。作為橡膠復(fù)合物成分的兩種CPTL在HR組中上調(diào)，CPTL1的表達(dá)水平顯著高于CPTL2（圖5）。作為結(jié)構(gòu)蛋白和穩(wěn)定橡膠顆粒的SRPP對NR合成至關(guān)重要，共鑒定出8個(gè)SRPPs（SRPP1–7,9），在NR生物合成相關(guān)的所有基因中表達(dá)水平最高。盡管在HR株組中SRPP1和SRPP2顯著下調(diào)，但表達(dá)水平最高的前3個(gè)株組的SRPP5、SRPP6和SRPP9明顯上調(diào)，并且HR株組中SRPPs的總體表達(dá)水平也高于LR株組（圖5）。涉及橡膠顆粒穩(wěn)定性的REF在HR組中的表達(dá)水平高于LR組。上述結(jié)果表明，參與NR合成的關(guān)鍵基因，尤其是CPTs和SRPPs的表達(dá)水平與NR產(chǎn)量成正比，這進(jìn)一步證明了這些基因在NR生物合成中的重要作用。

菊粉是一種豐富的代謝物，僅在TKS根部積累，被認(rèn)為是一種碳儲(chǔ)存源，可用于生產(chǎn)NR的乙酰輔酶A。本研究確定了菊粉代謝途徑中的三個(gè)主要基因。其中，編碼蔗糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶（1-SST）的基因在HR組中上調(diào)，而編碼果聚糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶（1-FFT）的基因下調(diào)。然而，在LR和HR組中，參與菊糖合成的兩個(gè)基因的表達(dá)水平?jīng)]有達(dá)到顯著不同的水平（圖5）。編碼1-果聚糖外水解酶（1-FEH）的基因催化菊糖降解，在LR和HR株組中具有相似的表達(dá)水平（圖5）。上述結(jié)果可能表明，LR株系中菊糖的儲(chǔ)存量比HR株系中多，HR株系中的游離蔗糖和游離乙酰輔酶A可用于MVA或MEP途徑，以促進(jìn)NR和三萜的產(chǎn)生。此外，菊粉降解可能不是合成MVA和NR的乙酰輔酶A的主要來源。

圖5 HR和LR系NR生物合成途徑基因表達(dá)比較

總結(jié)

在本研究中，利用ONT技術(shù)獲得了含有LR和HR組的TKS組的高質(zhì)量全長根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并對LR和HR組進(jìn)行了比較根轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果表明，NR生物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)水平與NR產(chǎn)量成正比。另一方面，NR與許多其他代謝產(chǎn)物（如倍半萜、三萜、二芳基庚烷、姜辣素、類黃酮等）在使用底物（IPP或乙酰輔酶A）時(shí)存在競爭關(guān)組。因此，本研究為TKS中NR生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新的見解。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)的與NR合成相關(guān)的基因或途徑將是未來基因改造和分子育種的重要目標(biāo)。