摘要

前言

研究結果

研究人員從代表了不同的發(fā)育時間和組織位置的17個單獨的胚胎中收集了77個腸道樣本繪制成單細胞圖譜 （Figures 1?A和1B），數據集范圍從8到22 PCW，跨越隱窩形成之前的時間點，直至成人狀絨毛/隱窩形態(tài)的發(fā)展（FiguresS1A）。使用寡核苷酸標記抗體，產生了76,592個細胞 (Figures 1A 和 S1B–S1I; STAR methods)。

聚類分析將這些細胞分為9個腸道小室，以轉錄特征分別標注-上皮細胞，成纖維細胞，內皮細胞（EC），周細胞，神經（ENS），肌瘤，間皮，肌成纖維細胞和免疫(Figures 1C 和 1D)，且具有明顯的區(qū)位和發(fā)育時間差異(Figures 1E 和 1F)?；陉P鍵標記基因進行的精細聚類注釋進一步確定了區(qū)室中的101個亞群，并利用基于圖的劃分抽象方法描述了它們之間的關系(Figure 1G; Table S1;STAR methods)。接下來，對轉錄因子(TF)調控網絡進行映射，以突出每種細胞類型的關鍵調控網絡，并重建細胞命運的“決策樹”(Figure S2A; STAR methods)。鑒定出了464個TF模塊(如上皮細胞發(fā)育中的ARID3A（FDR<2.2e-16、coeff= 0.350），成纖維細胞中TCF21 （FDR<2.22e-16, coeff = 0.299），概述了已知的發(fā)育調節(jié)劑（例如用于腸內分泌細胞[EEC]分化的PAX4）以及306個發(fā)育發(fā)育階段和44個不同位置的調控網絡（例如，回腸末端的FOXD1?（FDR <2.22e-16，coeff = 0.026）(Figure S2B)。同樣，繪制了所有101種細胞類型之間的串擾圖，確定了成對細胞群之間的假定受體-配體（RL）相互作用（每個簇對多達179個旁分泌相互作用，包括2,252個RL對）(FigureS2?C;?STAR methods）。

對跨腸發(fā)育的組織進行空間轉錄組分析（5個樣品中的8個切片; 12 PCW，n = 5; 19 PCW，n = 1;成人，n = 2）（Figure 1A）。ST斑點的轉錄特征分析確定了每張幻燈片中的5-13個斑點簇，它們映射到離散位置(Figure2A)。使用單細胞圖譜作為參考，利用因子分析來確定每個斑點可能的scRNA-seq組成，從而在空間上定位所有scRNA-seq簇。與此同時，利用成人上皮細胞進行scRNA-seq預測了成人和胎兒的空間細胞類型分布（GEO：GSE116222，GSE125970），基質(GEO: GSE114374) 和免疫(DUOS-000110) 。

來自成年細胞群體（如隱窩頂部結腸細胞和成肌纖維細胞）的轉錄組學特征也位于適當的解剖位置（Figure2B）。RET顯示在肌間神經叢和粘膜下淋巴濾泡的PTPRC（CD45）有斑點特異性表達（Figure 2B）。

成對細胞類型信號相關性分析強調了幾種細胞類型（如，BEST4 / OTOP2細胞和結腸細胞）的顯著同點共現(xiàn)，與預期的原位細胞定位一致（Figure2Ci）。大多數ST斑點簇是分層分布的，突出了與組織深度相對應的轉錄/細胞空間變異性的*大決定因素。

研究人員鑒定了2,893個與深度相關的基因（<5％FDR），反映了不同層次的活躍途徑(Figure Cii) -肌肉/神經過程(收縮/軸突形成)向吸收管腔功能(微絨毛組織和消化系統(tǒng)過程)發(fā)展的深度富集點，與細胞類型特征的順序富集相符（Figure?2Ciii）。在胎兒ST顯著的差異包括外肌層和內肌層在19個PCW時占據離散的空間層，而不是12個PCW時(Figure 2D)。

子宮上皮隱窩的形成建立了維持粘膜屏障的終生回路。該研究捕獲了17,622個上皮細胞，這些上皮細胞易于區(qū)分其吸收性（腸上皮細胞和BEST4/OTOP2細胞），分泌性（EEC，杯狀細胞和分泌性祖細胞），未分化（遠距離擴增[TA]和近端TA）以及干細胞（近端和遠端ISC）基因標簽（Figure 3A；Table S1）。吸收性細胞基因的表達反映了類似于成人上皮的成熟光譜。研究人員觀察到由高特異性基因表達（例如CCL25和APOE）（Figure3A和3B）劃定的近端（小腸[SI]）和遠端（結腸）樣品之間的位置差異很大，通過軌跡分析和幾個TF模塊進行了證實（FigureS3一種）。這表明，在隱窩形成之前，位置特異性轉錄程序就已經建立起來了。

研究人員觀察到近端和遠端ISCs隨著時間的推移逐漸增加。這與ISC轉錄程序的早期位置差異形成對比，例如遠端LEFTY1和近端FOXD1及其下游調控網絡基因（Figure3C，3D和S3B）。這些差異由關鍵的位置信號轉通路支撐，例如，結腸LEFTY1通過激活素A受體（ACVR2B）參與了假定的神經相互作FigureS3?C1）。在早期發(fā)育中（<12 PCW），研究人員發(fā)現(xiàn)了近端上皮干樣祖細胞群，該細胞群發(fā)展為早期腸上皮細胞。這些細胞表現(xiàn)出許多原始功能，包括在中胚層分化重要的VTN基因高表達，與ISCs相比，LGR5表達較少，和ONECUT2表達參與上皮發(fā)育（Figure 3B和FigureS3?D）。這些細胞在SI中特異表達TF GATA4(Figure3Ei)， SI是一種小鼠早期內胚層調節(jié)因子，在12 PCW后，其表達大部分丟失這些細胞高表達轉鐵蛋白(TF)( Figure3B和3F)，證實了鐵代謝在絨毛形成中的重要性。LGR5是一種典型的ISC基因，在妊娠早期(<12 PCW)的近端/遠端廣泛檢測到低水平ISCs和干樣祖細胞（Figure3B和FigureS3D）。原位雜交（ISH）證實了在10PCW處彌漫的LGR5表達，后來定位于隱窩堿基（Figure3G），類似于在雞和小鼠發(fā)育中報道的Lgr5的行為。即使在隱窩形態(tài)建立之后（如19 PCW之后），ISC仍分別構成遠端/近端樣本中捕獲的上皮細胞的18％–22％（Figure3C），高于成人結腸的scRNA-seq研究捕獲的3%-4%。與此相符，研究人員發(fā)現(xiàn)ASCL2?TF模塊（包括下游目標LGR5）隨著發(fā)育時間的增加而顯著增加（Figure3H）。

分泌型譜系細胞在12 PCW時出現(xiàn)，在8-10 PCW時檢測到很少的杯狀細胞。然而，12 PCW后的杯狀細胞和EEC逐漸增加，反映出持續(xù)的成熟（Figure3A和S3E）。分泌細胞進一步細分為11個簇，反映了不同的EEC亞型（A/M，D和腸嗜鉻/I/L/N細胞）以及SI特異性Paneth細胞，杯狀細胞和NEUROG3?+祖細胞群（FigureS3?F;TableS1）。與其他EEC亞型不同的是，較早檢測到Paneth細胞旁邊的I細胞和A細胞（FigureS3F）。RL映射建立了核心EEC信號通路，如腸嗜chromaffin細胞，常見于結腸12pcw，通過多種途徑與抑制性運動神經元相互作用，包括TPH1-HTR2B，一種已知的食欲/運動中的5 -羥色胺信號通路(Figure S3Cii)。因此，隨著隱窩的形成，EEC多樣性和相關網絡在很大程度上得以建立。

相比之下，BEST4/OTOP2細胞在隱窩形成之前的時間點出現(xiàn)，轉錄水平已經不同(Figure 3I)，并且隨著時間的推移頻率沒有變化(Figure S3Gi)，這表明它們的發(fā)育可能與正常的隱窩-絨毛回路無關。此外，RL分析預測BEST4/OTOP2與神經元細胞之間有很強的相互作用(同樣在發(fā)育早期建立);例如，抑制性運動神經元表達神經遞質VIP，通過受體VIPR1的表達介導分泌BEST4 / OTOP2細胞(Figure S3Gii)。

腸道發(fā)育需要三種胚層細胞類型之間的√確相互作用。研究人員鑒定了8個部分的78個非上皮細胞簇，根據它們的轉錄、時間和位置分類(16個成纖維細胞，4個肌成纖維細胞，2個間皮細胞，12個上皮細胞，8個周細胞，13個神經細胞，12個免疫細胞，11個肌肉細胞) (TableS1)。在這些細胞中，觀察到協(xié)調的分化動態(tài)，一些群體首先發(fā)生變化，從而可能建立關鍵的生態(tài)位，為其他細胞鋪平道路，而在其他細胞群中，共定位群體則同步進化。

轉錄標簽通常對應于結構特征。在EC中可以清楚地看到這一點，將EC分為靜脈，動脈和淋巴管類型，并通過血管大小進一步區(qū)分（Figure4?A；TableS1）。在發(fā)育過程中，觀察到了從小血管到大血管的過渡，反映了腸道血管生成（Figure S4?A）。確定了驅動這種變化的TF網絡，例如動靜脈分化器HEY1和SOX13。成年ST的脈管系統(tǒng)很容易識別成年EC和胎兒EC信號（Figure S4?B）。與EC相對的，周細胞亞型由血管生成驅動因子（PRRX1，THBS4和ANGPT2）定義（Figure 4?B；table S1）。ANGPT2是EC-周細胞RL相互作用的關鍵調節(jié)因子，已證實其位于胎兒脈管系統(tǒng)中（Figure S4C）。盡管EC隔室與8 PCW處存在的大血管細胞截然不同，但周細胞種群顯示出發(fā)育滯后。為了了解這些分化動力學，研究人員將G2M和S期周細胞與G1期細胞進行了比較，發(fā)現(xiàn)在較早時間點的大多數細胞是高度循環(huán)的祖細胞（Figure S4?D）。這些種群與成纖維細胞和原始的ACTA2?+細胞共享轉錄特征，這一結果受到軌跡分析的支持（Figure S4?E）。綜上所述，提出了早期成纖維細胞向周細胞的轉變，然后是來自未成熟WNT6表達細胞的第二波周細胞增殖-分化。16 PCW時，成熟的成肌纖維細胞表現(xiàn)出相似的發(fā)育滯后（Figure 4?Ci；table S1）。文獻表明腸道成肌纖維細胞可能來自多種來源，并且圖形抽象顯示成熟的成肌纖維細胞類似于肌肉細胞，在特定基因（例如RSPO2，F(xiàn)igure 4?Cii）中存在明顯差異。然而，肌成纖維細胞祖細胞卻表現(xiàn)出來自成纖維細胞和周細胞的梯度譜;在19 PCW的ST中，它們占據了與過渡間質細胞相鄰和重疊的層。（Figure 4?D和S4?E）。

與PCW7-8晚期發(fā)展出現(xiàn)的細胞類型相反，腸神經嵴來源的細胞沿胃腸道的長度遷移，進入包含神經元和膠質細胞的粘膜下和肌間神經叢。本研究的時間點（Figure4E）確定了不同的神經元和神經膠質祖細胞，并捕獲了5個神經膠質細胞和7個神經元簇（FigureS5 Ai；tableS1）。除了RL分析突出的不同ENS通路（圖S3C），同時還表明ENS與其他部分相比相對成熟。在ST中，ENS成分也被清楚地看作是肌間神經（FigureS5 Aii）。

在成年腸道中，神經元叢被肌肉包圍。祖細胞和分化的腸平滑肌細胞（iSMCs）分別由PLPP2和ACTA2等基因標記（Figure4 F;TableS1）。本研究確定了11個與iSMC相關的簇，包括PDGFRA +間隙細胞和Cajal間隙細胞的早期種群（FigureS5 B）。通過10 PCW觀察到內（IM）和外（OM）肌肉的形成。這些層在胎兒腸中的發(fā)育順序尚不清楚，有相互矛盾的報道表明兩者同時發(fā)育或IM首先發(fā)育。與前者一致，觀察到分化浪潮，結腸肌層滯后于較成熟的近端組織，早期樣品以祖細胞為主，而分化的遠端肌層粘膜（MM），OM和IM細胞在12歲后大量出現(xiàn)PCW（FigureS5 C）。在19 PCW處而非12 PCW處的結腸ST中，肌肉層是分開的并且在視覺上是不同的（FigureS5D）。確定了描繪肌細胞的關鍵TF網絡。KLF7在肌肉中，TWIST2在間質細胞和OM細胞中（FigureS5E）。FOXF2在IM中具有特異性活性（Figure4F），這與前期的小鼠相關報道一致。此外，據報道，F(xiàn)oxf2 -/-小鼠胚胎致死，伴隨有薄壁結腸，腸神經元數量減少，扁平的上皮細胞和未發(fā)育的成纖維細胞。這一發(fā)現(xiàn)與平滑肌介導的機械力是引發(fā)絨毛形成的可能性相吻合。

發(fā)育中腸道內不同的室間由間充質細胞支撐，間充質細胞是腸內*大的室間（24,081個細胞）?；诔扇藄cRNA-seq中建立的命名法將成纖維細胞命名為stromal-1-4 (S1-S4)亞型。根據時間，位置和周期的差異進一步將它們細分為16個類（Figure 4 G；Table S1；STAR方法）。S1細胞的3個簇形成了黏膜下層結構細胞的主體，而S2細胞（由F3，NPY和FOXL1標記）表達的標志物與隱窩周圍的細胞群相似，對上皮的發(fā)育和形成至關重要（Figure S6 A）。與成人相比，S3-like細胞不僅在子宮內形成了一個主要的成纖維細胞群，而且表現(xiàn)出更大的異質性。一些S3簇具有高表達的原始標記(HAND1、WNT4和DLK1)，以及成人標記S3基因(C7和CCDC80)。軌跡分析確定了一個分支點，未成熟的S3-like細胞分裂為S3或S1/2/4譜系，這些譜系可以被譜系特異性的TF網絡(如NR2F1)分化，NR2F1也在肌成纖維細胞中表達。研究人員發(fā)現(xiàn)S3-like祖細胞在增殖室中高度富集，表明這些細胞可能在這一時期產生大量分化成纖維細胞。

為了更好地理解S3亞型功能，研究人員研究了RL互作，注意到與EC的大量串擾預測（FigureS6D）。其中許多是通過調節(jié)結腸成纖維細胞中組織纖溶酶原激活受體LRP1介導的。為了在ST數據中證實這一點，研究人員進行了RL空間共表達分析，該分析確定了在空間上對隱窩頂部進行強空間共定位的RL對，例如CEACAM1和CEACAM5（FigureS6Ei）。在成人和胎兒組織中觀察到LRP1與血管外基質的關鍵成分HSPG2配體的顯著共定位(p = 2.17×10^-112和p = 2.37×10^-29（成人）；p = 2.9×10^-19和 p = 0.005（12 PCW) (Figure S6Eii和S6Eiii)。在胎兒ST中，研究人員將S3簇定位于與EC相關的深度和區(qū)域（Figure4Hi），將幾種S3特異性基因（如FigureC7）的表達定位于成年組織中與脈管結構相鄰的斑點，因為這些結構比胎兒切片更清晰可見（Figure4Hii）。將胎兒細胞類型標簽轉移到成人ST上，發(fā)現(xiàn)S3 HAND1 +和S3 EBF +細胞的成年配對體聚集在大血管周圍(Figure4Hiii–4Hiv)，突顯了這些細胞在形成腸血管支持位支持生態(tài)位中發(fā)揮的作用，已通過成對細胞類型信號相關性分析證實，其中EC，周細胞和“S3”型成纖維細胞信號在同一ST點內相關（Figure 2Ci）。

理解腸道發(fā)育的基本問題是局部形態(tài)發(fā)生梯度及其拮抗劑是如何塑造腸絨毛形態(tài)發(fā)生的。研究人員創(chuàng)建了一個涉及8條途徑的基因形態(tài)發(fā)生圖，用以闡明這些分子在空間和時間上的作用。利用共表達分析確定了11種細胞類型特異性和13種空間共定位的形態(tài)發(fā)生模塊，在所有ST中對模塊活性進行了評分（Figure5A和S7?A）。這些模塊通常與ST中的組織深度對齊，空間模塊3由來自EC、成纖維細胞和周細胞起源的形態(tài)發(fā)生子組成，包括LRP1，并且在組織深處（Figure5?Bi）。上皮特異性模塊表達了Hedgehog通路（IHH）的基因，例如在Wnt信號中起重要作用的卷曲的共受體LRP5，并位于管腔附近（Figure5?Bii）。另一個含有肌纖維母細胞成分的細胞，具有形態(tài)發(fā)生原WNT2B和受體RSPO2，在12PCW時出現(xiàn)彌漫性，并在以后逐漸定位（FigureS7?B）。這與發(fā)現(xiàn)成熟的成肌纖維細胞在上皮成分后出現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)一致，表明ISC-成纖維細胞信號傳導回路直到隱窩形成后才建立。WNT2B由間皮表達，在成肌纖維細胞分化之前提供了配體的唯一來源（FigureS7B）。類似地，RSPO3，其可以用信號通知經由ISC的LGR5（FigureS7Ci）在間皮/肌層模塊中很高，主要在12 PCW之前見到，然后隨著時間的流逝隨著組織深度的增加而消失（Figure5C）。這表明，隨著腸的生長，原本可能因層間物理距離的增加而被打破的形態(tài)梯度，可以通過依次發(fā)育的細胞類型的表達而恢復。

周圍隱膜S2成纖維細胞或端粒細胞通過表達生長因子β（TGF-β）超家族配體和WNT通路來提供上皮支持。從TGF-β（BMP2，BMP4和BMP5）和非典型WNT通路（WNT5A和WNT5B）（Figure S6 A）。這些S2特異性基因形成了一個主要的粘膜下成纖維細胞形態(tài)發(fā)生模塊（scRNA-seq模塊2），該模塊包含DLL1，BMP5和NRG1（Figure 5 D）。連同RL相互作用（例如DLL1 – NOTCH2（Figure S7 Cii））一起，這突出顯示了S2細胞及其提供的富含形態(tài)原的利基在上皮細胞形成中的重要性。與其他成纖維細胞種群不同，TI和結腸S2細胞不同，有885個差異表達基因（<5％FDR）（FigureS7 D），包括POSTN或TI突出的PDGFRA的結腸特異性表達（Figure S7 D）。在10 PCW之前發(fā)現(xiàn)許多位置差異，這表示在隱窩/絨毛形式之前具有很強的位置同一性-例如POSTN和BMP3在它們各自的S2亞型中很早就被發(fā)現(xiàn)（Figure 5 E）。S2形態(tài)發(fā)生譜中的關鍵位置差異提示了一種機制，通過該機制可以發(fā)展出極大不同的上皮形態(tài)。

最后，研究人員證實S2標記F3在隱窩形成之前就已經存在，并且形成的小丘隨著絨毛的形成而逐漸增加（Figure 5 F）。因此，在人腸道中，S2型纖維母細胞不僅是維持上皮隱窩位所必需的，而且可能在其形成中發(fā)揮積極作用。

人類腸道免疫力的發(fā)展

該研究中得到的圖譜捕獲了發(fā)育過程中來自6個譜系(巨噬細胞，單核細胞，樹突狀細胞，嗜酸性粒細胞，適應性和先天淋巴細胞)的2199個免疫細胞（Firgure6A和6B；Table S1；STAR methods）。免疫細胞在SI中（占捕獲的所有細胞的3％–8％）比結腸（平均占1％– 2.5％）更為普遍，總體而言在孕早期之前尤其罕見。在10 PCW之前，研究人員觀察到了髓樣細胞富集（Figure S8 A），而在12 PCW時，涌入了大量的幼稚CD4⁺和CD8⁺T細胞，自然殺傷細胞（NK），1型先天性淋巴樣細胞（ILC），以及3型ILC（Firgure 6C）。后者在胎兒腸道中的患病率比成人高得多，在某些晚期樣本中占所有捕獲的免疫細胞的30％。

胎兒ILC3表達IL7RA和ID2（TableS1），這對小鼠子宮Peyer’s斑塊（PPs）的形成至關重要，因此將這些細胞區(qū)分為3型淋巴組織誘導劑（LTi）。PP的形成是一個LTi細胞、EC和基質細胞之間相互協(xié)調作用的過程。此外，鼠類研究顯示其還需要RET/ARTN/GFRA3神經軸，而GFRA3缺乏會導致PP發(fā)育受損。腸道相關淋巴樣組織（GALT）的形成被認為在出生前以PPs的形式出現(xiàn)在SI體內，而在出生后以結腸的形式出現(xiàn)。相反，在此，研究人員確定了一個獨特的結腸而不是SI特異的神經膠質種群，它是發(fā)育過程中唯一的GFRA3來源，并在15 PCW時擴展（Figure6 D），表明在人類結腸發(fā)育過程中可能存在類似的神經免疫回路。

PP形成的其他關鍵介質包括通過CCL19，CCL21和CXCL13促進LTi組織歸巢的基質組織細胞。研究人員發(fā)現(xiàn)這些特異性地定位于兩個S4成纖維細胞簇，并且表達隨著發(fā)育而增加（Figure6B和6E）。在S4簇中繪制RL相互作用的圖譜突出顯示了與各種免疫細胞的串擾，包括通過VCAM1 – ITGB7的ILC3信號傳遞（FigureS8 B）。這進一步支持了S4在淋巴樣組織形成中的作用-這些粘附分子是GALT形成所必需的。LTi細胞和S4細胞還表現(xiàn)出通過IL7和CCL19/21與它們的受體IL7R/CCR7的相互作用（FigureS8C），如果小鼠中不存在，則會導致無法形成次級淋巴濾泡。

為了在空間上確認這些相互作用，研究人員研究了成人ST，其中粘膜下淋巴濾泡被視為獨特的結構。S4和免疫細胞（例如CD3和CD19）的關鍵標記基因在這些卵泡中和周圍表達，因子分析證實了各種成年免疫細胞（B細胞，T細胞和髓樣細胞）和此處定位的S4細胞類型（Figure6） F）。研究人員還發(fā)現(xiàn)ST中關鍵RL對的顯著共定位（包括CCR7 / CC19（1個點內p = 1.098×10 -10，半徑內p = 5.59×10 -49）（Figure6G）。表明S4細胞是成年結腸中與卵泡相鄰的成纖維細胞，在胎兒GALT發(fā)育過程中以時間依賴性方式出現(xiàn)。

兩個S4簇在很大程度上都是SI特異的，維持PP的子宮發(fā)育，但不維持結腸GALT，并且在12 PCW之前完全不存在（FigureS8 D）。比較這兩個種群的轉錄譜，發(fā)現(xiàn)S4 CXCL13 +亞型表現(xiàn)出許多隱性S2成纖維細胞的關鍵特征（POSTN，F(xiàn)3，PDGFRA和BMP5），并且是RANKL/TNFSF11的唯一腸道來源（FigureS8E）-其缺陷導致PP形成受損，并且是PP中M細胞分化所必需的。綜上，PP中相同的隱周成纖維細胞起著上皮隱窩位支持細胞，淋巴組織形成的協(xié)調者和間質免疫串擾介體的作用，從而揭示了它們迄今未曾意識到的高度動態(tài)的作用。

該研究在時間方面允許研究隨著發(fā)育時間而變化的疾病基因（Figure7D），并可以提供與時間相關的信息，突出顯示PCW前12膠質細胞和IM祖細胞表達的基因HMGA2（分別為FDR<2.2e-16）（Figure7Ei），與腸道旋轉不良有關（12q14微缺失綜合癥，ORPHA：94063）。同樣，早期抑制運動神經元特異的NXN的致病變體（Figure7Eii）會導致卵泡擴張（Robinow綜合征，OMIM：618529）。在此發(fā)育時期，腸子回到了腹部，表明ENS細胞和肌肉祖細胞可能對該過程至關重要。

總結