Bulked Segregant Analysis（BSA）分析是利用極端性狀個(gè)體混池快速進(jìn)行功能基因挖掘的常用方法，廣泛應(yīng)用在植物基因克隆方面。SLAF-seq是百邁客自主研發(fā)的簡化基因組測序技術(shù)，通過對基因組特定的酶切片段進(jìn)行高通量測序，在降低基因組復(fù)雜度的基礎(chǔ)上，又獲得大量的基因組變異信息，在群體遺傳研究中發(fā)揮著重要作用。將SLAF-seq和BSA分析完美結(jié)合（SLAF-BSA）進(jìn)行功能基因定位，是一種快速、準(zhǔn)確、性價(jià)比極高的分析策略。日前，由百邁客和揚(yáng)州大學(xué)陳學(xué)好教授課題組合作，利用SLAF-BSA策略定位黃瓜耐淹基因，相關(guān)研究成果發(fā)表于新一期的Plant Journal雜志。本期圖譜君將對這一成果解讀，同時(shí)文末繼續(xù)有基于遺傳群體進(jìn)行基因定位的國自然標(biāo)書，期待能給大家3月份的國自然基金申請帶來一些靈感。

英文標(biāo)題：The major-effect QTL CsARN6.1 encodes an AAA-ATPase domain-containing protein that is associated with waterlogging stress tolerance through promoting adventitious root formation
中文標(biāo)題：CsARN6.1編碼的AAA-ATPase基因通過促進(jìn)不定根形成增強(qiáng)黃瓜耐水淹性
發(fā)表期刊：the Plant Journal， 2018
影響因子：5.90

背景
高等植物需要一定量的氧氣來保持代謝和生長，然而在水淹狀態(tài)下，土壤中氧含量比正常情況下低320,000倍，植物根系可利用氧氣含量降低，進(jìn)而影響植物根系的很多生長和代謝生理過程。水淹情況下，大量有害物質(zhì)積累也會造成對植物的毒害作用。以上變化將嚴(yán)重影響植物生長、干物質(zhì)積累以及植物最終的產(chǎn)量。所以，分離植物耐水淹基因、揭示耐水淹分子機(jī)制、開展耐水淹品種選育具有重要意義。

黃瓜是重要的蔬菜品種，其根生長淺，對氧氣需求較為嚴(yán)格，這造成它對水淹脅迫非常敏感。在水淹脅迫下，黃瓜下胚軸通過產(chǎn)生不定根來獲取氧氣，以適應(yīng)水淹脅迫。為解析水淹脅迫下黃瓜不定根生產(chǎn)現(xiàn)象的遺傳學(xué)機(jī)制，研究者曾利用耐水淹材料Zaoer-N 和不耐水淹材料Pepino構(gòu)建的群體進(jìn)行QTL定位，已經(jīng)分離了一個(gè)控制不定根數(shù)目的主效QTL ARN6.1，該QTL在多年的實(shí)驗(yàn)均解釋了較高的表型貢獻(xiàn)率。本研究將對該QTL進(jìn)行精細(xì)定位，確定引起性狀差異的基因，并進(jìn)行多方面的驗(yàn)證。

材料方法

主要結(jié)果
1.不定根數(shù)目是數(shù)量性狀且與水淹脅迫耐受力顯著相關(guān)
表型觀察發(fā)現(xiàn)，水淹處理7天后，Zaoer-N幼苗下胚軸生長出許多不定根，而Pepino幾乎沒有（圖1）；通過對F2群體表型統(tǒng)計(jì)，所有子代的不定根數(shù)目表現(xiàn)出正態(tài)分布，這也說明了該性狀為數(shù)量性狀（圖2）。另外，對F2群體的949個(gè)個(gè)體進(jìn)行水淹耐受力評估打分，發(fā)現(xiàn)不定根數(shù)目與水淹耐受力之間呈顯著正相關(guān)，皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.72（P = 0.05），這表明不定根數(shù)目可以作為衡量水淹耐受力的可靠指標(biāo)。

圖1 Zaoer-N和Pepino不定根生長情況

圖2 F2群體不定根數(shù)目分布統(tǒng)計(jì)

2、ARN6.1的初定位
利用SLAF-seq的方法對親本及兩個(gè)極端混池進(jìn)行測序，親本測序深度分別為29.18×和22.85×，兩個(gè)混池的深度分別為50.6×和53.72×，以9930為參考基因組，利用△SNP-index和ED的方法計(jì)算顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，將關(guān)聯(lián)區(qū)域定位在6號染色體標(biāo)記SLAF_marker_192310和SLAF_marker_192096之間，區(qū)間大小301kb（圖3）。

圖3 BSA定位結(jié)果

3、ARN6.1的精細(xì)定位
利用定位區(qū)間側(cè)翼SLAF標(biāo)記（SLAF_marker_192310和SLAF_marker_192096）上的SNP，分別各開發(fā)KASP標(biāo)記（KASP1和KASP13），并對2274個(gè)F2子代進(jìn)行分型，獲得33個(gè)重組個(gè)體；再在KASP1和KASP13之間開發(fā)11個(gè)KASP標(biāo)記，對33個(gè)重組個(gè)體進(jìn)行基因分型，共得到8種單倍型。結(jié)合重組個(gè)體基因分型和表型數(shù)據(jù)，將ARN6.1定位到61.5kb的區(qū)間（KASP10和KASP11）（圖4a）。為進(jìn)一步縮小區(qū)間，利用KASP10和KASP11對4417個(gè)F2個(gè)體進(jìn)行分型，得到6個(gè)重組個(gè)體，這6個(gè)重組個(gè)體分別自交得到6個(gè)F2:3家系，然后利用新開發(fā)的5個(gè)dCAPS對F2:3家系進(jìn)行分型，結(jié)合所有表型數(shù)據(jù)，最終將ARN6.1定位在36.1kb的范圍內(nèi)（圖4b）。對該區(qū)進(jìn)行注釋，共有7個(gè)基因（圖4c），有趣的是，其中5個(gè)基因都被預(yù)測為編碼AAA 型的ATP酶家族蛋白。

圖4? ARN6.1精細(xì)定位過程

2個(gè)親本重測序分析，在36.1kb的區(qū)間內(nèi)開發(fā)到25個(gè)SNP，為確定哪個(gè)SNP與性狀真實(shí)相關(guān)，研究者對100個(gè)黃瓜自交系的23個(gè)SNP（2個(gè)SNP只存在于Zaoer-N中而被過濾掉）進(jìn)行分型，結(jié)合每個(gè)自交系不定根數(shù)目的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行局部關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示SNP02與表型有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。對SNP02分析發(fā)現(xiàn)，其位于Csa6G504460的第二外顯子，可能就是引起變異的SNP位點(diǎn)（圖5a）。

圖5 Csa6G504460的分離及表達(dá)量分析

4、表達(dá)分析驗(yàn)證Csa6G504460
前期研究中，研究者對親本Zaoer-N和Pepino幼苗下胚軸在水淹處理后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，以上定位區(qū)間內(nèi)的7個(gè)基因只有Csa6G504460在處理組和對照組間存在差異表達(dá)，并且差異表達(dá)只發(fā)生在Zaoer-N中（圖5b）。而后，研究者對這7個(gè)基因又進(jìn)行qRT-PCR分析，同樣發(fā)現(xiàn)只有Csa6G504460在Zaoer-N的處理組和對照組間存在差異表達(dá)，并且在處理后36h表達(dá)量差異出現(xiàn)峰值（圖5c）。另外，組織特異表達(dá)分析表明Csa6G504460在多個(gè)組織中均有表達(dá)，但是在根中的表達(dá)量顯著高于其他組織。因此，從基因表達(dá)角度驗(yàn)證了Csa6G504460（以下命名為CsARN6.1）的真實(shí)性。

5、CsARN6.1突變體降低ATP酶活性
基因組和cDNA序列分析顯示，CsARN6.1擁有2個(gè)外顯子，被預(yù)測為編碼含有511個(gè)氨基酸殘基的AAA-ATPase結(jié)構(gòu)域蛋白，該蛋白中含有一個(gè)coiled-coil結(jié)構(gòu)域（圖6），前期關(guān)聯(lián)到的SNP02即位于該結(jié)構(gòu)域，由于該SNP的突變導(dǎo)致Asp被替換成Gly，Zaoer-N為CsARN6.1^Asp型，表現(xiàn)出較強(qiáng)的ATP酶活性，而Pepino為CsARN6.1^Gly型，幾乎沒有ATP活性（圖7）。

圖6 AAA-ATPase基因結(jié)構(gòu)?

圖7 CsARN6.1^Asp和CsARN6.1^Gly蛋白活性比較

6、轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證
為驗(yàn)證CsARN6.1的功能，將CsARN6.1^Asp轉(zhuǎn)入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的根長顯著長于對照，同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株上可以明顯觀察到側(cè)根發(fā)育，而對照組則沒有側(cè)根發(fā)育（圖8）。為進(jìn)一步驗(yàn)證，研究者將CsARN6.1^Asp轉(zhuǎn)入黃瓜品種Xintaimici（CsARN6.1^Gly型），并經(jīng)多代自交和篩選，獲得單拷貝的純合轉(zhuǎn)基因植株。發(fā)芽后3天，轉(zhuǎn)基因植株的初生根長度顯著長于野生型。水淹處理后，轉(zhuǎn)基因黃瓜下胚軸中CsARN6.1的表達(dá)量顯著高于野生型。處理后7天，轉(zhuǎn)基因黃瓜下胚軸的不定根數(shù)目明顯高于野生型（圖9 e.f.g.h）。另外，野生型黃瓜葉片和子葉的萎黃病較轉(zhuǎn)基因黃瓜嚴(yán)重。以上轉(zhuǎn)基因結(jié)果證實(shí)CsARN6.1能夠促進(jìn)不定根形成和黃瓜水淹耐受力（圖9 i.j）。

圖8 轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型表型比較?

圖9 轉(zhuǎn)基因黃瓜與野生型表型比較?

7、ATP酶活性影響黃瓜不定根形成
前期研究發(fā)現(xiàn)，EDTA能夠抑制AAA-ATPase蛋白的ATP酶活性。研究者通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EDTA處理的CsARN6.1^Asp蛋白的ATP酶活性相對于對照降低24%（圖10 a）。隨后，研究者用加入EDTA的水處Zaoer-N幼苗，以檢測ATP酶活性損耗對下胚軸不定根的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EDTA處理后，Zaoer-N沒有了不定根生成能力（圖10 b.c）。
進(jìn)化樹分析顯示，CsARN6.1與擬南芥At2G18190和At3G50930存在較高的同源性（圖10d），而在之前研究中發(fā)現(xiàn)，H2O2處理擬南芥后，At2G18190.1和At3G50930.1被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。水淹后植物體內(nèi)H2O2積累是普遍的生理響應(yīng)。因而研究者嘗試在水中加入H2O2后處理Zaoer-N幼苗，與無水處理的對照相比，48h后處理組植株CsARN6.1的表達(dá)量是對照組的4.3倍，與不加H2O2的水處理的對照相比，48h后CsARN6.1的表達(dá)量是對照組的2.1倍（圖10 e）。5天后統(tǒng)計(jì)不同處理的材料下胚軸不定根數(shù)目，發(fā)現(xiàn)與不加H2O2的水處理的對照相比，水中加入H2O2的處理組的不定根數(shù)目增加60%（圖10 f.g）。

圖10 EDTA及H2O2處理對ATP酶和黃瓜生根的影響

參考文獻(xiàn)（點(diǎn)擊下載文獻(xiàn)原文）
Xu X, Ji J, Xu Q, et al. The major‐effect QTL CsARN6.1 encodes an AAA‐ATPase domain‐containing protein that is associated with waterlogging stress tolerance through promoting adventitious root formation[J]. Plant Journal, 2018.