Ps:李順昌教授團(tuán)隊(duì)多次合作利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序全面精準(zhǔn)揭示糖尿病相關(guān)發(fā)病機(jī)制和治療策略，其實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)值得大家借鑒參考。

研究背景

心臟重構(gòu)和功能障礙是糖尿病常見(jiàn)的并發(fā)癥，常導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管事件。MOTS-c是一種線粒體衍生肽，通過(guò)加速葡萄糖攝取和提高胰島素敏感性來(lái)調(diào)節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)。目前發(fā)現(xiàn)，MOTS-c不僅可改善心臟與血管內(nèi)皮功能，且其含量在糖尿病患者血漿中明顯下降，使其成為糖尿病心血管并發(fā)癥的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。所以，該研究旨在探究MOTS-c對(duì)糖尿病心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響并利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)挖掘其中的分子機(jī)制。

材料方法

對(duì)照組（C，n?= 10）和糖尿病前組（PD，n?= 30）。PD組的大鼠服用含有67%正常顆粒、10%豬油、20%蔗糖、2%膽固醇和1%膽酸鈉（16）的高脂肪飲食7周，糖尿病大鼠被隨機(jī)分為兩組：（1）糖尿病組（未經(jīng)治療）（D），（2）用MOTS-c（M）治療的糖尿病大鼠，取對(duì)照組（C）、未治療組（D）、治療組（M）大鼠心臟組織，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）。

研究思路

研究結(jié)果

1. MOTS-c顯著降低糖尿病空腹血糖與胰島素抵抗

MOTS-c治療8周后，D組和M組大鼠體重低于C組（圖1a和圖1e）。與D組相比，M組大鼠空腹血糖水平降低（圖1b）。此外，與C組相比，D組和M組大鼠胰島素水平下降，D組和M組間胰島素水平無(wú)顯著差異（圖1c）。通過(guò)計(jì)算HOMA-IR指數(shù)評(píng)估胰島素抵抗。與C組相比，D組大鼠的HOMA-IR指數(shù)顯著升高，而M組大鼠HOMA-IR指數(shù)較D組降低。

圖1. MOTS-c干預(yù)后各組大鼠空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR與體重的變化

2. MOTS-c有效改善糖尿病心臟結(jié)構(gòu)和功能

該研究利用透射電鏡測(cè)定了MOTS-c對(duì)糖尿病心肌超微結(jié)構(gòu)的影響。糖尿病引起心肌纖維排列紊亂和線粒體結(jié)構(gòu)的異常改變，包括心肌細(xì)胞排列不規(guī)則、嵴破裂、腫脹和空泡化（圖2）。MOTS-c治療糖尿病大鼠顯著降低心肌線粒體損傷，改善心肌纖維和線粒體結(jié)構(gòu)（圖2）。研究還通過(guò)測(cè)定檸檬酸合酶的活性，測(cè)定了線粒體功能。D組大鼠檸檬酸合酶的活性顯著降低，C組和M組的檸檬酸合酶的活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3g）。

使用M型超聲心動(dòng)圖測(cè)定大鼠心臟功能。D組大鼠LVPWd值明顯升高，提示左心室出現(xiàn)病變（圖3d）。與C組相比，D組大鼠EF值下降（圖3b），提示糖尿病對(duì)照組大鼠心臟收縮功能受損。D組糖尿病大鼠的E峰值和A峰值均下降，而A峰值下降更快，因此增加了E/A比值（圖3c、3e和3f）。M組和C組在EF、E/A、LVPWd、E峰值和A峰值方面均無(wú)差異（圖3b-3f），表明MOTS-c心臟舒張功能和收縮功能。

圖2. 各組大鼠心肌組織透射電鏡圖像

圖3. 各組大鼠超聲心動(dòng)圖影像與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3. 差異表達(dá)基因的篩選

為了進(jìn)一步探究糖尿病大鼠對(duì)MOTS-c的適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制，研究者利用RNA-Seq技術(shù)，測(cè)定了心肌組織基因全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)。以C組為對(duì)照，D組表現(xiàn)出的差異表達(dá)基因（DEGs）即致病基因，再以D組為對(duì)照組篩選出M組的差異表達(dá)基因，二者篩選出的DEGs中重疊的基因即為MOTS-c改變的致病基因。將以上步驟執(zhí)行，篩選出47個(gè)MOTS-c改變的致病基因（圖4a）。將這47個(gè)基因進(jìn)行熱圖分析后發(fā)現(xiàn)，C組基因表達(dá)趨勢(shì)與D組相反，而與M組近似（圖4b）。

圖4. 差異表達(dá)基因的篩選

4.差異表達(dá)基因的功能富集分析

采用Gene Ontology（GO）與Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）對(duì)MOTS-c所改變的47個(gè)致病基因進(jìn)行功能富集分析。GO 注釋系統(tǒng)包含三個(gè)主要分支，即：生物學(xué)過(guò)程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組分（CC）。）8 周 MOTS-c 注射所改變的 47 個(gè)糖尿病致病基因共富集于 195 個(gè) GO term 中，其中 188 個(gè) term 富集于 BP，2 個(gè) term 富集于 CC，5 個(gè) term 富集于MF。經(jīng)過(guò) ClueGO 聚類分析后，195 個(gè) term 主要富集于 9 個(gè)類別（見(jiàn)圖 5b），分別為血管生成（angiogenesis）、凋亡過(guò)程調(diào)控（regulation of the apoptotic process）、MAPK 級(jí)聯(lián)調(diào)控（regulation of MAPK cascade）、蛋白激酶活性正調(diào)控（positive regulation of protein kinase activity）、脂肪酸代謝過(guò)程（fatty acid metabolic process）、吞噬作用調(diào)節(jié)（regulation of phagocytosis）、蛋白激酶 B 信號(hào)正調(diào)控（positive regulation of protein kinase B signaling）、ERK1/2 級(jí)聯(lián)（regulation of ERK1/2 cascade）、膠質(zhì)生成（gliogenesis）和白細(xì)胞介素-1 的產(chǎn)生（interleukin-1 beta production）。KEGG通路富集分析顯示，18條KEGG通路顯著富集（圖5b），其中5條信號(hào)通路與免疫、凋亡和糖代謝相關(guān)（ErbB信號(hào)通路、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、c型凝集素受體信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路和AGE-RAGE信號(hào)通路）。在功能富集通路注釋基因中，ALOX15、ATF3、CCN1、EGR1、EGR3、ERRFI1、THBS1、TLR2和NRG1高頻率注釋。CCN1與EGR1基因高表達(dá)，同時(shí)均注釋在凋亡相關(guān)的GO term中，而CCN1也注釋于富集顯著性最高的ERK1/2級(jí)聯(lián)通路中，表明CCN1、ERK1/2與EGR1可能是相互關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵基因。

圖5. GO與KEGG功能富集分析

5. MOTS-c對(duì)CCN1 / ERK1/2 / EGR1信號(hào)通路的影響

為了驗(yàn)證CCN1、ERK1/2與EGR1是否在MOTS-c改善糖尿病心臟結(jié)構(gòu)與功能中發(fā)揮重要作用，也為了進(jìn)一步探究MOTS-c對(duì)線粒體發(fā)生的作用，研究者利用RT-PCR與Western Blotting技術(shù)測(cè)定了CCN1、ERK1/2、EGR1的基因表達(dá)與蛋白表達(dá)以及線粒體發(fā)生標(biāo)志蛋白PGC-1α的蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，MOTS-c治療后，糖尿病大鼠心肌中PGC-1α蛋白表達(dá)顯著上升（圖7a）；CCN1、ERK1/2和EGR1基因表達(dá)顯著降低（圖6）；CCN1、EGR1蛋白表達(dá)顯著降低，ERK1/2的總蛋白表達(dá)量不變（圖7），但多個(gè)研究表明MOTS-c僅影響ERK1/2的磷酸化水平。

圖6. 各組大鼠心肌中CCN1、ERK1/2與EGR1的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)

研究結(jié)論

為期8周的MOTS-c治療減少了糖尿病患者的心功能障礙與線粒體損傷，MOTS-c可能是通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸代謝、免疫調(diào)節(jié)、血管生成和細(xì)胞凋亡產(chǎn)生作用。CCN1/ERK1/2/EGR1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能在MOTS-c抑制心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn)

Manda Wang, Gangqiang Wang, Shunchang Li, et al. MOTS-c repairs myocardial damage by inhibiting the CCN1/ERK1/2/EGR1 pathway in diabetic rats. Front. Nutr., 04 January 2023Sec.

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轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析目前比較模式化，要想贏得審稿人青睞，必須要結(jié)合具體的科學(xué)問(wèn)題做針對(duì)性展示。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析挖掘幾步走？我們將眾多的分析內(nèi)容歸納為4大類：所有基因挖掘、差異基因挖掘、表達(dá)量挖掘、高級(jí)工具挖掘。

1、所有基因挖掘

針對(duì)所有檢測(cè)到的基因，我們可以用基因名稱、功能注釋、序列信息等進(jìn)行檢索篩選；基于篩選的關(guān)鍵基因或者前期研究結(jié)果，重點(diǎn)關(guān)注某類基因家族，從序列信息比對(duì)、功能結(jié)構(gòu)域保守性分析、家族進(jìn)化樹(shù)分析、表達(dá)模式分析等進(jìn)行研究，進(jìn)而解析基因家族與生物學(xué)性狀的關(guān)系。

2、差異基因挖掘

差異基因挖掘是基于差異基因篩選，實(shí)現(xiàn)不同分組間差異表達(dá)基因的比較、功能注釋和通路富集分析等，解析參與生物學(xué)過(guò)程的關(guān)鍵基因及其功能。

3、表達(dá)量挖掘

表達(dá)量挖掘可以根據(jù)各個(gè)基因的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)不同樣品中共同表達(dá)和特異表達(dá)的基因的篩選，如組織特有表達(dá)基因篩選、不同處理樣品間特異表達(dá)基因篩選、不同發(fā)育時(shí)期特異表達(dá)基因篩選等，并對(duì)特定基因進(jìn)行后續(xù)功能分類分析，如聚類分析，表達(dá)模式分析等。

4、高級(jí)工具挖掘

高級(jí)工具挖掘主要是整合基因表達(dá)量與表型數(shù)據(jù)、互作信息、其他組學(xué)信息，進(jìn)行基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（WGCNA）、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖、組學(xué)聯(lián)合分析等，解析基礎(chǔ)代謝過(guò)程和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

針對(duì)上面這些分析內(nèi)容，百邁客生物云平臺(tái)免費(fèi)開(kāi)放了不限次的個(gè)性化挖掘和108款作圖小工具，一鍵出圖。百邁客云于2014年5月正式開(kāi)放，經(jīng)過(guò)6年的打磨，轉(zhuǎn)錄組云分析（次賬號(hào)）集結(jié)可視化數(shù)據(jù)分析APP、個(gè)性化分析小工具、文獻(xiàn)檢索、公共數(shù)據(jù)庫(kù)、培訓(xùn)視頻，是科研工作者項(xiàng)目管理一站式平臺(tái)。在這個(gè)風(fēng)起“云”涌的時(shí)代，百邁客云以快速、全面、透明的姿態(tài)全面起航。

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研究背景

水稻是最重要的糧食作物之一，在過(guò)去的50年里，通過(guò)雜交育種已經(jīng)大幅度提高了水稻的產(chǎn)量。然而雜交育種最近幾年也遇到了瓶頸，多倍體化則成為水稻育種的另一條思路。多倍體化能夠提高優(yōu)勢(shì)基因發(fā)生重組和相互作用的可能性，提高水稻對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。

同源四倍體水稻（autotetraploid rice）是二倍體水稻經(jīng)過(guò)染色體加倍形成的新種質(zhì)。同源四倍體水稻亞種間雜種F1具有強(qiáng)大的生物學(xué)優(yōu)勢(shì)，蘊(yùn)含著巨大的增產(chǎn)潛力，可望成為未來(lái)水稻育種的新途徑。然而，其雜種F1普遍存在育性偏低，產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)難以發(fā)揮，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上難以直接應(yīng)用的問(wèn)題。所以，如何創(chuàng)制育性正常且能克服雜種F1不育性的新型四倍體（neo-tetraploid）是利用其優(yōu)勢(shì)的關(guān)鍵。

為了避免同源四倍體水稻育性偏低的問(wèn)題，華南農(nóng)大某研究組經(jīng)過(guò)20年的努力，培育出2個(gè)新型四倍體水稻，其結(jié)實(shí)率可達(dá)80%以上，于2016年獲得國(guó)家植物新品種權(quán)。本研究旨在通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，研究新型四倍體（Huaduo 3）與同源四倍體雜交F1代的花藥、子房和葉片的基因表達(dá)情況，為解析新型四倍體育性和雜種優(yōu)勢(shì)的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

材料方法

新型四倍體水稻Huaduo 3（H3），40種不同的同源四倍體水稻，以及雜交F1代。同源四倍體水稻 Huajingxian 74-4x（T452）與H3的雜交F1代用于測(cè)序分析。
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：取T452，H3及雜交F1代的三種不同組織分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，包括減數(shù)分裂階段的花藥、減數(shù)分裂階段的子房、開(kāi)花階段的旗葉。每個(gè)組織每種品系有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共27個(gè)樣品。測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq 2500，平均每個(gè)樣品測(cè)約5G。
小RNA測(cè)序：取T452，H3及雜交F1代的減數(shù)分裂階段的花藥進(jìn)行小RNA測(cè)序，無(wú)生物學(xué)重復(fù)。
全基因組重測(cè)序：兩個(gè)親本T452和H3的葉片DNA用于全基因組重測(cè)序。
嗯，測(cè)序手段還是挺多滴！

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1.新型四倍體水稻Huaduo 3（H3）的育種及其與其它四倍體水稻的雜交過(guò)程
將兩種同源四倍體水稻（Jackson-4x和96025）進(jìn)行雜交，獲得F1代雜交種。F1代雜交種再進(jìn)行連續(xù)自交，到F5代時(shí)發(fā)現(xiàn)一株水稻有80%的結(jié)實(shí)率，這株水稻經(jīng)過(guò)多代連續(xù)自交，到F10-F13代時(shí)出現(xiàn)可以穩(wěn)定遺傳的高結(jié)實(shí)率性狀，這個(gè)品系被命名為Huaduo 3（H3）。H3不僅結(jié)實(shí)率高，還有其它高產(chǎn)性狀（表1），其花粉母細(xì)胞有90%以上是正常的。
將H3與40種其它品系的同源四倍體水稻（26個(gè)印度種和14個(gè)日本種）進(jìn)行雜交，獲得的40種F1代表現(xiàn)出了很多大大優(yōu)于親本的性狀，尤其是單株谷粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、單株產(chǎn)量等性狀。為了進(jìn)一步研究雜交F1代的雜種優(yōu)勢(shì)，我們挑選了T452和H3的雜交F1代進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究。T452是一種育性較低的同源四倍體，雜交F1代的高親優(yōu)勢(shì)幾乎都是正的，除了谷粒長(zhǎng)度和10谷粒寬度兩個(gè)指標(biāo)。雜交F1代的中親優(yōu)勢(shì)除了10谷粒寬度這一個(gè)指標(biāo)以外都是正的，說(shuō)明雜交F1代表現(xiàn)出了明顯的雜種優(yōu)勢(shì)。
高親優(yōu)勢(shì)（High-parent heterosis，HPH）是指雜交F1代的產(chǎn)量或者某一數(shù)量性狀的數(shù)值與高值親本（HP）同一性狀數(shù)值差值的比率。高親優(yōu)勢(shì)（%）=(F1-HP)/HP*100%。
中親優(yōu)勢(shì)（Mid-parent heterosis，MPH）指雜交F1代的產(chǎn)量或者某一數(shù)量性狀的數(shù)值與雙親（P1和P2）同一性狀的平均值差值的比率。中親優(yōu)勢(shì)（%）=[F1-(P1+P2)/2]/(P1+P2)/2*100%。

表一：T452與H3雜交F1代的雜種優(yōu)勢(shì)。HPH：高親優(yōu)勢(shì)；MPH中親優(yōu)勢(shì)；PH：植株高度；EP：?jiǎn)沃旯攘?shù)；FG：?jiǎn)位ü攘?shù)；SS：結(jié)實(shí)率；GYP：?jiǎn)沃戤a(chǎn)量；GL：10谷粒長(zhǎng)度；GW：10谷粒寬度。

圖1：親本和雜交F1代的表型。（A）Jackson-4x（T45），Huaduo 3（H3）與96025（T44）的谷粒大小，H3是來(lái)自T45和T44的雜交；（B）H3在大田中的長(zhǎng)勢(shì)；（C）T45，H3，T44的植物表型；（D）Shennong15-4x（T424），H3，以及兩者雜交F1代的表型。

2.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
因?yàn)門(mén)452和H3的雜交F1代表現(xiàn)出了優(yōu)良性狀，因此可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究性狀差異的原因。取T452，H3及雜交F1代的三種不同組織分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，包括減數(shù)分裂階段的花藥、減數(shù)分裂階段的子房、開(kāi)花階段的旗葉?？偣矞y(cè)了548M clean reads，平均有89.06%的reads可以比對(duì)到參考基因組上，其中93.45%都是比對(duì)到唯一位置上。三個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性都達(dá)到了0.8以上。用qRT-PCR的方法對(duì)12個(gè)差異表達(dá)基因（DEG）的表達(dá)量進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果一致。對(duì)不同樣品進(jìn)行層次聚類分析表明，相同組織的樣品總能聚到一塊（圖2）。

圖2：所有基因的層次聚類分析。AN：花藥；OV：子房；LE：葉片。

3.差異表達(dá)基因（DEG）分析及注釋
在三個(gè)不同株系中共發(fā)現(xiàn)17877個(gè)DEG，兩兩比較的DEG數(shù)目在1521到2498之間（表2）。F1和親本之間的DEG稱為DEGF，親本之間的DEG稱為DEGP。DEGF的基因能分為兩個(gè)不同的組，其中一個(gè)組在DEGP里面也有，另一個(gè)組只屬于DEGF，后者被稱為DEGFu。這些DEGFu基因能夠解釋F1和親本之間的表型差異，因此接下來(lái)的研究種重點(diǎn)關(guān)注DEGFu基因。在這17877個(gè)DEG里面，有1150，1014，1122個(gè)DEGFu與花藥、子房、葉片有關(guān)，其中分別有807，663，866個(gè)基因與花藥、子房、葉片特異相關(guān)，這些基因被稱為DEGFu-sp。

表2：三個(gè)不同組織中的差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)。AN：花藥；OV：子房；LE：葉片。

為了研究DEGFu-sp基因的功能，我們首先研究了其中的轉(zhuǎn)錄因子，共發(fā)現(xiàn)了44個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，花藥里面16個(gè)，子房里面10個(gè)，葉片里面18個(gè)。對(duì)DEGFu-sp基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明這些基因相互之間有顯著的聯(lián)系，多個(gè)代謝通路富集程度較高。

GO富集分析表明花藥中的DEGFu-sp基因有19個(gè)生物學(xué)過(guò)程類別顯著富集，包括光合作用、代謝途徑、合成調(diào)控和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。6個(gè)通路類別顯著富集，包括光合作用和代謝通路。13個(gè)基因在F1中的表達(dá)量顯著高于T452。在807個(gè)花藥特異的DEGFu-sp中，15個(gè)基因與46個(gè)其它重要基因共表達(dá)。

接下來(lái)用同樣的方法對(duì)子房和葉片中的DEGFu-sp基因進(jìn)行了GO富集分析。在葉片當(dāng)中有5個(gè)基因在F1中表達(dá)量顯著高于T452。H3水稻葉片在開(kāi)花過(guò)程中顏色逐漸變化，而T452葉片在開(kāi)花過(guò)程中顏色保持不變。因此，我們比較了葉片中F1比T452上調(diào)的基因，以及H3比T452上調(diào)的基因，兩者有74.01%的重合。有趣的是，在葉片中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)主要的功能基因類別，分別是程序性細(xì)胞死亡和防御反應(yīng)。

4. 花藥特異性差異表達(dá)基因與減數(shù)分裂有關(guān)

因?yàn)門(mén)452育性較低，而F1代育性較高，為了研究育性的差異，我們重點(diǎn)研究了F1花藥中與T452相比上調(diào)的基因。首先，有643個(gè)基因在F1花藥中與T452相比特異上調(diào)，這其中排除了H3與T452相比上調(diào)的基因。對(duì)這643個(gè)基因進(jìn)行GO分析表明，有6個(gè)功能基因類別富集，這些基因與防御反應(yīng)、光合作用、細(xì)胞凋亡和程序性細(xì)胞死亡有關(guān)。這其中有41個(gè)基因在育性較低的同源四倍體中表達(dá)量低于二倍體。在這41個(gè)基因中，4個(gè)基因，LOC_Os04g33830，LOC_Os12g08770，LOC_Os06g21590，LOC_Os07g25430，與光合作用有關(guān)。

接下來(lái)，將這643個(gè)特異上調(diào)的基因與野生型水稻花藥減數(shù)分裂相關(guān)基因的表達(dá)量相互比較，發(fā)現(xiàn)有9個(gè)基因都在減數(shù)分裂前期到四分體期表達(dá)。

隨后，我們比較了花藥特異性差異表達(dá)基因DEGFu-sp和野生型水稻減數(shù)分裂相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)，共發(fā)現(xiàn)有42個(gè)減數(shù)分裂特異性基因和8個(gè)減數(shù)分裂相關(guān)基因（圖3）。在8個(gè)減數(shù)分裂相關(guān)的基因中，有兩個(gè)基因和DNA修復(fù)和染色體結(jié)構(gòu)有關(guān)。

因?yàn)檗D(zhuǎn)錄組也會(huì)被表觀遺傳調(diào)控，我們也進(jìn)了小RNA測(cè)序。在花藥中發(fā)現(xiàn)了288個(gè)差異表達(dá)的miRNA（DER），其中有13個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的。在這288個(gè)DER中，有38個(gè)只在F1與親本相比中特有，這38個(gè)基因被稱為DERFu。這38個(gè)DERFu有397個(gè)靶標(biāo)基因。GO分析表明這397個(gè)靶標(biāo)基因有7個(gè)功能基因類別富集，這些基因與細(xì)胞凋亡、防御反應(yīng)、程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞自噬、DNA完整性和脅迫反應(yīng)有關(guān)。而且，大部分靶標(biāo)基因同于F1或者H3中上調(diào)的基因。然后我們比較了這38個(gè)DERFu與之前發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)miRNA數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)miRNA，osa-miR5072_L-2_1ss3AG，在

Taichung65-2x和 Taichung65-4x水稻中的四倍體中下調(diào)。這個(gè)miRNA靶標(biāo)基因?yàn)?LOC_Os02g24960，是一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因。

圖3：與育性和雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)的基因在染色體上分布。紅色為葉片中的基因，藍(lán)色為花藥中的基因，黑色為子房中的基因。

表3：花藥中的差異表達(dá)miRNA（DER）列表

5.雜交F1代非累加基因表達(dá)
F1代表達(dá)的基因可以分成兩個(gè)類別，一類是累加基因，一類是非累加基因。累加基因的表達(dá)量來(lái)自兩個(gè)親本的等位基因之和，非累加基因的表達(dá)量由兩個(gè)親本等位基因的平均值決定。在三個(gè)組織中共發(fā)現(xiàn)了1224個(gè)非累加基因（NDEG），在花藥、子房和葉片中分別為314個(gè)，578個(gè)，332個(gè)。其中895個(gè)上調(diào)，329個(gè)下調(diào)。通過(guò)對(duì)花藥NDEG和水稻花藥減數(shù)分裂特異性基因表達(dá)數(shù)據(jù)的比較，發(fā)現(xiàn)了53個(gè)共有的基因。其中有7個(gè)基因在四倍體中表達(dá)量低于二倍體水稻。

表4：非累加表達(dá)基因（NDEG）和DEGFu及不同組織的DEGFu-sp數(shù)量統(tǒng)計(jì)。星號(hào)表示NDEG在F1表達(dá)的總基因中的比例。

6.DNA序列差異與雜交F1代的差異表達(dá)基因之間的關(guān)系
DNA重測(cè)序表明T452和H3有很多序列差異，兩者共有2351039個(gè)SNP，其中1192412個(gè)SNP在T452中特異存在，374460個(gè)SNP在H3中特異存在。兩者共有499448個(gè)Indel，其中248194個(gè)Indel在T452中特異存在，84196個(gè)Indel在H3中特異存在。將T452和H3相比，SNP和Indel多態(tài)性分別為66.77%和69.97%。在這些多態(tài)性位點(diǎn)中，約65%的SNP和72%的Indel在基因區(qū)。47.67%的SNP和53.37%的Indel位于差異表達(dá)基因的調(diào)控區(qū)域。另外，有58908個(gè)SNP和5561個(gè)Indel位于基因編碼區(qū)。
因?yàn)門(mén)452和H3存在大量的DNA序列差異，我們分析了DEGFu-sp中基因的DNA序列差異，結(jié)果表明花藥、子房和葉片中分別有330個(gè)、291個(gè)、459個(gè)基因存在DNA序列差異（SNP或Indel）?；ㄋ幭嚓P(guān)的330個(gè)基因可以分為15個(gè)不同的生物學(xué)過(guò)程類別，主要和光合作用、細(xì)胞代謝、轉(zhuǎn)錄和生物合成有關(guān)。子房相關(guān)的基因有1個(gè)生物學(xué)過(guò)程富集，即代謝通路。同樣的，葉片相關(guān)的基因有8個(gè)生物學(xué)過(guò)程富集，包括氮代謝、細(xì)胞運(yùn)輸?shù)?。這些富集的生物學(xué)過(guò)程基本上與DEGFu-sp富集的生物學(xué)過(guò)程一致。
另外，非累加差異表達(dá)基因中也有SNP和Indel，花藥、子房和葉片中分別有67個(gè)、133個(gè)、87個(gè)基因存在DNA序列差異，并對(duì)這些基因進(jìn)行了富集分析。其中25個(gè)基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子。

結(jié)論

本研究培育了一個(gè)新型四倍體水稻H3，H3與同源四倍體T452雜交產(chǎn)生的F1代具有育性高、產(chǎn)量高等優(yōu)良的雜種優(yōu)勢(shì)性狀。通過(guò)比較H3，T452，以及雜交F1代的三個(gè)不同組織（花藥、子房、葉片）的轉(zhuǎn)錄組差異，尤其是重點(diǎn)分析了花藥的轉(zhuǎn)錄組差異，找到了多個(gè)與減數(shù)分裂有關(guān)的差異表達(dá)基因，這些基因可能與雜種優(yōu)勢(shì)有關(guān)。對(duì)花藥的小RNA測(cè)序也找到了一些F1中差異表達(dá)的miRNA，這些miRNA的靶基因也與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中上調(diào)的基因有大部分重合，說(shuō)明miRNA可能參與調(diào)控了雜交F1代的性狀差異。對(duì)兩個(gè)親本DNA序列的差異進(jìn)行全基因組重測(cè)序分析，并與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，找到了DNA層面上兩者育性差異的可能原因。

創(chuàng)新點(diǎn)

培育出高結(jié)實(shí)率的新型四倍體水稻，可以用于四倍體水稻育種；
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較了新型四倍體水稻，同源四倍體水稻及雜交F1代不同組織的轉(zhuǎn)錄組差異，找到了影響四倍體水稻育性和雜種優(yōu)勢(shì)的相關(guān)基因；
小RNA測(cè)序和全基因組重測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相結(jié)合，深入解析性狀差異原因。

點(diǎn)評(píng)

這篇文章選取的實(shí)驗(yàn)材料很好，性狀優(yōu)良，而且研究得很深入，比較了三種水稻三個(gè)不同組織的轉(zhuǎn)錄組，還進(jìn)行了小RNA測(cè)序和全基因組重測(cè)序。通過(guò)深入分析，找到了一些影響水稻育性和雜種優(yōu)勢(shì)的相關(guān)基因，為后續(xù)的育種工作打下了基礎(chǔ)。
對(duì)多種測(cè)序手段結(jié)合分析感興趣的小伙伴快來(lái)試試吧！

參考文獻(xiàn)

Guo H, Mendrikahy J N, Lei X, et al. Transcriptome analysis of neo-tetraploid rice reveals specific differential gene expressions associated with fertility and heterosis[J]. Scientific reports, 2017, 7:40139.

有沒(méi)有什么辦法，降低洋蔥辛辣的刺激性，提高洋蔥的甘甜的口感呢？

2016年9月，百邁客與北京農(nóng)林科學(xué)院蔬菜所的一項(xiàng)研究為解決這個(gè)問(wèn)題提供了理論基礎(chǔ)。前人已有的研究表明，淀粉或蔗糖代謝在球莖的形成和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。為了分析洋蔥在球莖膨大過(guò)程中蔗糖的代謝和甜味的發(fā)展情況，我們利用RNA-seq對(duì)三個(gè)不同發(fā)育階段的洋蔥球莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

英文名稱：Transcriptome Analysis of Sucrose Metabolism during Bulb Swelling and Development in Onion (Allium cepa L.)
雜志：frontiers in plant science
影響因子：4.495

實(shí)驗(yàn)材料

洋蔥球莖，每組樣本3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

DAS：day after swelling。

實(shí)驗(yàn)思路

文章結(jié)果

經(jīng)過(guò)測(cè)序分析，我們最終鑒定了參與洋蔥球莖形成和發(fā)育的差異表達(dá)基因，篩選出與蔗糖、葡萄糖和果糖代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因。

1.質(zhì)量評(píng)估和數(shù)據(jù)過(guò)濾后共獲得72.53M clean reads。Q30在85%以上。說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和數(shù)據(jù)量滿足后續(xù)分析。用trinity將reads組裝到79376條Unigenes，平均長(zhǎng)度為678bp。ContigN50為1093bp。

2.用BLASTX將組裝得到的序列與Nr，Swiss-Prot，GO，COG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，共有8288個(gè)Unigenes注釋到了25個(gè)COG類別中的11713個(gè)功能。有585個(gè)Unigenes注釋到“碳水化合物的運(yùn)輸和代謝”。

3.為了鑒定在洋蔥球莖膨脹過(guò)程中活躍的通路，將得到的unigenes與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)參考通路進(jìn)行比對(duì)。15 DAS vs. 30 DAS注釋到了95個(gè)pathway，15 DAS vs. 40 DAS 注釋到了79個(gè)pathway，30 DAS vs. 40 DAS注釋到了86個(gè)pathway。共有6113個(gè)unigenes注釋到了120條KEGG通路中。“淀粉和蔗糖代謝”構(gòu)成了各樣本文庫(kù)中的初級(jí)代謝途徑，并有可能在球莖膨大和發(fā)育過(guò)程中活性更高。

4.設(shè)置P < 0.01和|log2 (fold change)|≥1，篩選出在球莖發(fā)育過(guò)程中的差異表達(dá)基因。在3個(gè)不同發(fā)育階段共獲得5416個(gè)差異表達(dá)基因。為深入了解洋蔥發(fā)育過(guò)程中蔗糖代謝，結(jié)合文獻(xiàn)中的已有的報(bào)道并根據(jù)洋蔥RNA測(cè)序數(shù)據(jù)注釋中的關(guān)鍵詞搜索共列篩選出147個(gè)差異調(diào)控淀粉和蔗糖代謝的關(guān)鍵基因。根據(jù)洋蔥球莖發(fā)育過(guò)程中蔗糖、葡萄糖、果糖水平的變化，挑選出6個(gè)差異表達(dá)基因可能在洋蔥球莖發(fā)育早期發(fā)揮重要作用，分別為CWIN，SUT，SuSy (SuSy1，SuSy2)和INV (INV1，INV2)。

5.使用qRT-PCR驗(yàn)證參與蔗糖代謝的差異表達(dá)基因。這6個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)水平與RNA-seq結(jié)果是一致的。

結(jié)論

本研究結(jié)果表明，程序化的基因表達(dá)以及不同發(fā)育階段中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量變化對(duì)球莖膨大十分重要。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于我們理解洋蔥球莖發(fā)育的分子機(jī)制具有重要作用。相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)，這些理論基礎(chǔ)就會(huì)運(yùn)用到實(shí)際當(dāng)中，提高洋蔥的糖分，降低氣味刺激性，到那時(shí)，媽媽再也不用擔(dān)心切洋蔥時(shí)會(huì)辣眼睛了。

參考文獻(xiàn)

Zhang C, Zhang H, Zhan Z, et al. Transcriptome Analysis of Sucrose Metabolism during Bulb Swelling and Development in Onion (Allium cepa L.)[J]. Frontiers in Plant Science, 2016, 7.