該研究揭示甘露糖富集的Cetobacterium?somerae能將日糧中的精氨酸在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)化為腐胺，并由肝臟進(jìn)一步代謝為亞精胺，從而發(fā)揮減輕高脂日糧誘導(dǎo)的肝脂蓄積的作用，這一發(fā)現(xiàn)不僅闡明了腸道微生物與宿主之間跨界協(xié)同產(chǎn)生有益代謝物的全新機(jī)制，也為理解腸肝軸在代謝健康中的作用提供了突破性視角。百邁客生物為該研究提供了全長微生物多樣性測序服務(wù)。

研究背景

最新研究發(fā)現(xiàn)腸-肝軸涉及兩個(gè)器官間的相互作用，能通過多種微生物代謝物實(shí)現(xiàn)的雙向交流，表明腸道來源的細(xì)菌代謝物可能對肝臟健康產(chǎn)生正向或負(fù)向影響。為探究腸-肝相互作用，高脂飲食（HFD）模型是最成熟的實(shí)驗(yàn)方法之一，腸道、微生物群與宿主肝臟之間的這種特殊相互作用表明腸道微生物可能產(chǎn)生許多尚未表征的代謝物，這些代謝物可循環(huán)至肝臟以影響肝功能。然而，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)任何腸道微生物代謝物經(jīng)肝臟代謝后轉(zhuǎn)化為有益于肝臟健康的成分。

研究結(jié)果

甘露糖補(bǔ)充緩解斑馬魚高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝

因?yàn)橐延袌?bào)道表明甘露糖可改變腸道菌群組成并緩解小鼠脂肪肝，為了確定通過甘露糖富集或選擇腸道菌群是否能改善肝功能，進(jìn)行了添加甘露糖的HFD喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。喂養(yǎng)試驗(yàn)后，?HFD組斑馬魚的體重增長和肝臟三酰甘油（TAG）含量較正常脂肪飲食（NFD）組顯著增加，表明成功建立了營養(yǎng)性脂肪肝模型。與HFD組相比，NFD、5M（5?g/kg）和10M（10?g/kg）組通過降低肝臟脂合成相關(guān)基因的表達(dá)，肝臟TAG含量顯著降低，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平顯著下降。H&E染色顯示，相比HFD組，5M和10M組肝臟的空泡數(shù)量和損傷評分明顯減少。5M和10M組肝臟促炎因子相關(guān)基因的表達(dá)也有所降低，總體而言，還觀察到HFD添加甘露糖后在形態(tài)學(xué)和分子水平上改善了斑馬魚的腸道健康。

圖1-甘露糖補(bǔ)充不能直接緩解HFD誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性，但會促進(jìn)C.somerae的生長

甘露糖補(bǔ)充改變腸道微生物群并選擇性富集CETOBACTERIUM

與HFD組相比，5M組和10M組中變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度顯著降低，而梭桿菌門（Fusobacteriota）的相對豐度顯著增加。與HFD組相比，5M組和10M組中梭桿菌屬（Cetobacterium）的相對豐度顯著增加。腸道微生物群的α多樣性指數(shù)（Chao1和Shannon）在各組間無顯著差異。LEfSe分析顯示，5M組斑馬魚腸道中梭桿菌屬（Cetobacterium）高度富集。梭桿菌屬（Cetobacterium）是梭桿菌門（Fusobacteriota）的一個(gè)屬，在魚類中僅由單一物種C.?somerae代表，該菌通常棲息于多種魚類的腸道中。

此外，PCoA顯示HFD組和5M組的腸道微生物群完全分離，表明甘露糖補(bǔ)充顯著改變了斑馬魚的腸道微生物群組成。Spearman相關(guān)性分析顯示，變形菌門及其包含的近緣單胞菌屬（Plesiomonas）和氣單胞菌屬（Aeromonas）的相對豐度與TAG含量呈顯著正相關(guān)，而梭桿菌門（Fusobacteriota）和梭桿菌屬（Cetobacterium）的相對豐度與肝臟甘油三酯含量呈顯著負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Cetobacterium、Plesiomonas和Aeromonas的豐度與肝臟TAG含量的關(guān)系，收集了斑馬魚和鯉魚的公共數(shù)據(jù)集。Spearman相關(guān)分析顯示，Cetobacterium與肝臟TAG含量呈一致的顯著負(fù)相關(guān)，而Plesiomonas和Aeromonas則沒有。

對C.?SOMERAE的基因組與生長分析揭示其代謝甘露糖的能力

為探究甘露糖補(bǔ)充后腸道中這些不同細(xì)菌類群豐度變化的原因，該團(tuán)隊(duì)對斑馬魚腸道中選定的菌株進(jìn)行了全基因組測序分析，包括C.?somerae?XMX-1,?Plesiomonas?shigelloides?CB5?和Aeromonas?veronii??XMX-5。結(jié)果證實(shí)這些菌株存在顯著的功能差異。

首先，三種菌株的基因組結(jié)構(gòu)存在明顯差異。由于甘露糖喂養(yǎng)的斑馬魚腸道中Cetobacterium相對豐度較高，進(jìn)一步比較了這三種細(xì)菌對單糖代謝途徑的差異。結(jié)果顯示，只有C.somerae具有代謝甘露糖的能力，進(jìn)一步的生長實(shí)驗(yàn)證實(shí)C.somerae可利用甘露糖作為其生長的主要碳源。相比之下，當(dāng)甘露糖作為主要碳源時(shí)，P.shigelloides?CB5和A.veronii?XMX?-5均未觀察到生長。

腸道C.?SOMERAE可減少斑馬魚肝臟脂肪蓄積

為明確甘露糖或C.?somerae是否能減少肝臟脂肪積累，研究了甘露糖對無菌（GF）斑馬魚肝臟脂肪積累的直接影響。結(jié)果證實(shí)，補(bǔ)充甘露糖的飲食并未減少肝臟脂肪積累，且與脂質(zhì)代謝和炎癥因子相關(guān)的基因表達(dá)未出現(xiàn)顯著變化。

然而，甘露糖改善的腸道菌群可減少斑馬魚肝臟脂肪積累。隨后，為直接驗(yàn)證C.?somerae補(bǔ)充對降低肝臟脂質(zhì)積累的影響，在喂食HFD的GF斑馬魚幼體中添加了濃度為106?CFUs/g的C.?somerae。與HFD組相比，補(bǔ)充C.?somerae的組別肝臟TAG含量和油紅染色顯著降低。C.?somerae對宿主的保護(hù)作用已在脂質(zhì)代謝和炎癥相關(guān)基因中得到證實(shí)。

此外，團(tuán)隊(duì)評估了P.?shigelloides?CB5或A.?veronii?XMX-5對肝臟降脂效果，證實(shí)這些菌株不影響斑馬魚肝臟脂肪含量。最后，發(fā)現(xiàn)C.?somerae可改善斑馬魚肝臟脂肪積累和腸道健康。

代謝組與基因組分析揭示了C.?SOMERAE中精氨酸-腐胺通路的存在

為探究C.?somerae可HFD下改善宿主肝臟健康的機(jī)制，結(jié)合基因組學(xué)和代謝組學(xué)分析以及同位素示蹤方法，來確定C.?somerae參與降低肝臟脂肪含量的活性成分。代謝組分析顯示，無菌培養(yǎng)基和C.?somerae上清液中的代謝物顯著分離，且組內(nèi)差異性較低。差異代謝物分析表明，腐胺是C.?somerae上清液中最豐富的代謝物之一。隨后團(tuán)隊(duì)基于C.?somerae的基因組序列注釋了腐胺代謝途徑中的主要酶，并發(fā)現(xiàn)C.?somerae擁有編碼精氨酸脫羧酶的基因，以及胍丁胺脫亞胺酶和N-氨甲酰腐胺酰胺酶的基因，從而從胍基丁胺中產(chǎn)生腐胺，這與其他細(xì)菌的研究結(jié)果一致。

此外，C.?somerae的全譜代謝組分析顯示，該細(xì)菌可利用精氨酸產(chǎn)生胍基丁胺并進(jìn)一步產(chǎn)生腐胺。進(jìn)一步的靶向代謝組分析表明，精氨酸在48小時(shí)被C.?somerae完全利用，腐胺含量達(dá)到2.22?μmol/mL。為驗(yàn)證該代謝途徑在C.?somerae中的存在，我們在培養(yǎng)基中添加了外源性同位素標(biāo)記的13C6?15N4-精氨酸。結(jié)果顯示，C.?somerae的上清液和細(xì)菌沉淀中均檢測到13C4?15N2-腐胺。最后，通過向培養(yǎng)基中補(bǔ)充D8-腐胺，驗(yàn)證C.?somerae是否能進(jìn)一步代謝腐胺生成亞精胺。結(jié)果表明，C.?somerae的上清液和細(xì)菌沉淀中均檢測到D8-腐胺，但未發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的亞精胺。綜合分析表明，C.?somerae可通過精氨酸代謝途徑產(chǎn)生腐胺，該代謝物可能具有降低肝臟脂質(zhì)的潛在作用。

圖2-亞精胺是改善HFD誘導(dǎo)性肝脂肪變性的效應(yīng)分子

腐胺對肝功能無直接影響，但其下游宿主代謝產(chǎn)物精脒可緩解脂肪肝病理改

亞精胺作為腐胺的下游代謝產(chǎn)物，已被證實(shí)可緩解肝臟脂肪變性，但未在C.somerae基因組中發(fā)現(xiàn)亞精胺合成酶（srm）基因，且在細(xì)菌上清液中也未檢測到該酶。此外，在C.somerae培養(yǎng)物的任何組分中均未檢測到13C415N2-亞精胺到D8-亞精胺。檢測了斑馬魚基因組，發(fā)現(xiàn)其確實(shí)存在可將腐胺代謝為亞精胺的亞精胺合成酶（EC:2.5.1.16）基因。采用斑馬魚肝臟（ZFL）細(xì)胞模型進(jìn)行的同位素示蹤實(shí)驗(yàn)顯示，?ZFL?細(xì)胞中檢測到總亞精胺中有57.78%為D8-亞精胺，表明?ZFL?細(xì)胞能夠?qū)8-腐胺代謝D8-亞精胺。

隨后研究團(tuán)隊(duì)通過ZFL的HFD模型驗(yàn)證腐胺和亞精胺是否會影響肝臟脂質(zhì)代謝。與對照組相比，腐胺和亞精胺處理的?ZFL?細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量顯著降低。為驗(yàn)證亞精胺對肝功能的影響，在ZFL細(xì)胞和斑馬魚幼體中敲低了亞精胺合成酶。沉默亞精胺合成酶后，腐胺處理組的降脂效果消失，而亞精胺處理組仍保持該效應(yīng)。

HFD斑馬魚中腐胺-亞精胺交叉對話的發(fā)現(xiàn)

為驗(yàn)證腸道微生物產(chǎn)生的腐胺是否可轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟作為亞精胺合成的前體，體內(nèi)同位素示蹤實(shí)驗(yàn)顯示：腸道中的D8-腐胺可通過血液轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，且肝臟可將84.50%的D8-腐胺代謝為D8-亞精胺，肝臟中亞精胺含量顯著高于腐胺。通過斑馬魚HFD模型進(jìn)一步驗(yàn)證了腐胺與亞精胺的降脂作用：與HFD組相比，腐胺和亞精胺處理組的肝臟甘油三酯含量均顯著降低；兩組肝臟中腐胺與亞精胺水平均恢復(fù)至正常水平。補(bǔ)充甘露糖和C.?somerae的實(shí)驗(yàn)組亦證實(shí)此結(jié)果，表明肝臟是腐胺轉(zhuǎn)化為亞精胺的主要代謝場所。

研究總結(jié)

該研究發(fā)現(xiàn)了一種涉及精氨酸-腐胺-亞精胺級聯(lián)代謝途徑的新機(jī)制，該機(jī)制通過腸道C.?somerae與宿主肝臟的協(xié)同作用改善肝臟脂肪變性。關(guān)于腸道-肝臟軸中微生物-宿主代謝相互作用產(chǎn)生有用代謝物亞精胺的新發(fā)現(xiàn)，提出了腸道-肝臟軸中宿主-微生物交叉對話的新概念。

中文題目：5-ASA的腸道微生物代謝降低了其在炎癥性腸病中的臨床療效

發(fā)表期刊：nature medicine

發(fā)表時(shí)間：2023

影響因子：82.9

研究背景

炎性腸病 (IBD)是一種慢性、使人虛弱的胃腸疾病，治療失敗率較高。目前尚無系統(tǒng)的方法預(yù)測對IBD療法的反應(yīng)。抗炎藥物美沙拉嗪，也被稱為5-氨基水楊酸 (5-ASA)，是IBD最常用的處方療法之一，通常在結(jié)腸內(nèi)發(fā)揮作用；然而，隨著時(shí)間的推移，超過一半的IBD患者對5-ASA沒有反應(yīng)或最終失去反應(yīng)。因此，有必要確定并消除此類治療失敗的原因。

研究思路

研究重點(diǎn)

1、來自IBD患者的多組學(xué)研究確定了5-ASA的使用

利用人類微生物組項(xiàng)目炎癥性腸病多組學(xué)數(shù)據(jù)庫（IBDMDB，http://ibdmdb.org），對79名克羅恩病（CD）或潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者的糞便樣本進(jìn)行多組學(xué)分析，共鑒定了1036個(gè)宏基因組（MGX）、440個(gè)元轉(zhuǎn)錄本（MTX）和508個(gè)非靶向代謝組（MBX），以及283個(gè)MBX-MGX對和213個(gè)MGX-MTX對。隨后針對13名新使用5-ASA的患者來確定5-ASA在體內(nèi)直接調(diào)節(jié)的特定糞便代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-ASA使用前后中的5-ASA和N-乙酰5-ASA水平呈顯著差異，且經(jīng)5-ASA治療后，賴氨酸合成途徑中的細(xì)菌代謝產(chǎn)物—2-氨基己二酸的含量減少，煙酸代謝也發(fā)生了顯著變化。

進(jìn)一步評估微生物、宿主和其他因素對這些差異顯著的代謝物的相對貢獻(xiàn)，最終發(fā)現(xiàn)5-ASA的藥物水平在確定5-ASA調(diào)節(jié)代謝物水平方面具有最大的預(yù)測能力（35%），其次是微生物組特征（15%）和其他宿主因素（7%）。隨后，通過另一個(gè)獨(dú)立的IBD患者隊(duì)列中鑒定并驗(yàn)證了兩種可能的5-ASA衍生物—N-丙?；?-ASA和N-丁?；?-ASA，它們的變化可以部分地由腸道微生物組來解釋。

圖1?5-ASA可直接影響糞便代謝組，并通過微生物組進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化

2、5-ASA代謝腸道微生物酶的鑒定

接下來確定參與5-ASA生物轉(zhuǎn)化的腸道微生物酶。首先對服用及未服用5-ASA的患者微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，最終鑒定了兩個(gè)顯著過表達(dá)的具有推定乙酰轉(zhuǎn)移酶功能的UniRef90基因簇：GNAT家族NAT（UniRef90 ID: C7H1G6）和乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶（UniRef90 ID: R6TIX3），以及四個(gè)具有乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的候選基因（IDs: R6CZ24, R5CY66, T5S060和A0A1C6JPG6）。隨后將糞便樣本分為N-乙酰5-ASA高水平和N-乙酰5-ASA低/陰性水平兩組，計(jì)算與N-乙酰5-ASA相關(guān)的每個(gè)元轉(zhuǎn)錄組基因簇的敏感性和特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了另外7個(gè)假定的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因簇與使用者的N-乙酰5-ASA水平呈正相關(guān)。最終得到的12個(gè)之前未被表征的候選乙酰轉(zhuǎn)移酶可分為硫解酶和酰基輔酶A N-?；D(zhuǎn)移酶兩組，其中?；o酶A NAT家族比硫解酶家族表現(xiàn)出更大的序列異質(zhì)性，且?；o酶A NAT酶幾乎都來自擬桿菌門，而硫解酶來自厚壁菌門。通過研究菌株水平的基因組，同樣發(fā)現(xiàn)了一部分普氏鐮孢菌株編碼相關(guān)的乙酰轉(zhuǎn)移酶。

圖2N-乙酰5-ASA微生物酶包括硫代酶和?；o酶A N-乙酰轉(zhuǎn)移酶

3、5-ASA失活酶生化特性的推定

為了推測硫解酶和?；o酶A NAT超家族具有潛在的5-ASA滅活能力，選用來自厚壁菌門的候選硫解酶CAG:176（UniRef90 ID: R6CZ24）和來自福氏假單胞菌的?；o酶A NAT（UniRef90 ID:C7H1G6）用于進(jìn)一步的生化表征。用已知的腸道鏈球菌酶作為陽性對照，對乙?；?-ASA采用體外質(zhì)譜分析，最終證實(shí)了厚壁菌CAG:176硫解酶和F. prausnitzii酰基輔酶A NAT具有使用乙酰輔酶A乙?；?-ASA的能力。

隨后測試了硫解酶對其他含胺基異生素（包括5-ASA異構(gòu)體4-ASA、異煙肼、普魯卡因胺和肼屈嗪）的乙?；钚裕Y(jié)果并未發(fā)現(xiàn)這些化合物的任何乙?；@表明了硫解酶的底物選擇性。此外，編碼第二個(gè)預(yù)測的硫解酶基因（R6TIX3）的Oscillibacter sp菌株KLE 1745的活培養(yǎng)物也能夠?qū)?-ASA乙?；癁镹-乙?；?-ASA。

為了深入了解厚壁菌CAG:176硫解酶（FcTHL）如何乙?；?-ASA，將FcTHL的乙酰化未配體晶體結(jié)構(gòu)疊加在乙?；蚪饷妇w結(jié)構(gòu)上，與來自充分表征的革蘭氏陰性分枝菌（ZrTHL）的乙酰輔酶A復(fù)合。隨后將FcTHL與NAT (PDB ID: 2PFR)的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，進(jìn)一步探究厚壁菌CAG:176硫解酶的推定活性位點(diǎn)是否類似于腸道鏈球菌NAT的活性位點(diǎn)，最終揭示了活性位點(diǎn)區(qū)域中的半胱氨酸和組氨酸三聯(lián)體。

圖3?5-ASA在體外的乙?；钚缘淖C實(shí)

4、IBD治療失敗與5-ASA代謝酶的宏基因組攜帶有關(guān)

基于臨床服用5-ASA的個(gè)體差異性，接下來檢查12種乙酰轉(zhuǎn)移酶的存在是否與5-ASA治療失敗有關(guān)。收集39名在任何時(shí)間點(diǎn)接受5-ASA治療及使用類固醇患者的609份糞便樣本，使用多變量邏輯回歸模型，調(diào)整與疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)了因素-年齡、性別、吸煙狀況和IBD亞型，納入每個(gè)參與者的NAT2表型來解釋宿主遺傳，最終發(fā)現(xiàn)糞便樣本中存在4種乙酰轉(zhuǎn)移酶基因與類固醇起始風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)。4種乙酰轉(zhuǎn)移酶基因有三種來自硫解酶超家族，一種來自?；o酶A超家族。且較早的發(fā)病年齡和CD與UC狀態(tài)相比，同樣與開始使用類固醇的更高風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。但未發(fā)現(xiàn)類固醇使用風(fēng)險(xiǎn)和大腸桿菌NAT的宏基因組存在聯(lián)系。

在敏感性分析中，微生物乙酰轉(zhuǎn)移酶基因數(shù)量的增加與類固醇起始風(fēng)險(xiǎn)的增加顯著相關(guān)；從未使用過5-ASA治療的患者基因家族與類固醇的使用沒有正相關(guān)。隨后使用混合效應(yīng)模型對參與者進(jìn)行調(diào)整，發(fā)現(xiàn)存在三個(gè)或更多乙酰轉(zhuǎn)移酶基因也與類固醇使用風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，這在隨后在未使用類固醇的208名5-ASA使用者隊(duì)列中得到了驗(yàn)證。

圖4腸道微生物5-ASA滅活乙酰轉(zhuǎn)移酶與5-ASA使用者治療失敗的更大風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)

研究總結(jié)

本研究結(jié)果首次提供了特異性腸道代謝酶與IBD 5-ASA治療失敗之間的直接聯(lián)系，從而產(chǎn)生了直接的臨床潛力。5-ASA是UC最常用的處方藥。為了保持有效，它必須以未修飾的形式存在于結(jié)腸腔中，因此，與其他藥物不同，它在小腸中的吸收很差。5-ASA治療失敗的個(gè)體通常進(jìn)展為風(fēng)險(xiǎn)更高的免疫抑制治療，而只有在必要時(shí) (即腸道微生物組中存在修飾5-ASA的硫解酶序列)才有能力這樣做，這將為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供有價(jià)值的生物標(biāo)志物。此外，闡明微生物失活5-ASA的酶學(xué)機(jī)制可能有助于未來研發(fā)微生物特異性酶抑制劑，以增強(qiáng)5-ASA的療效。在本研究中，我們的數(shù)據(jù)是觀察性的；需要更多的介入研究來加強(qiáng)我們的發(fā)現(xiàn)，無論是通過在IBD患者中的臨床試驗(yàn)還是通過單定植小鼠。目前，這些發(fā)現(xiàn)為IBD的個(gè)性化微生物醫(yī)學(xué)打開了一扇概念之窗。