該研究揭示了玉米中一個關(guān)鍵的表觀遺傳調(diào)控因子mop1在塑造減數(shù)分裂重組圖景中的核心作用。通過高分辨率的全基因組重組圖譜分析，研究團隊發(fā)現(xiàn)，mop1功能的缺失會以一種性別特異性的方式改變重組事件的發(fā)生位置，其背后的機制是通過調(diào)控一類被稱為“微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座子”（MITEs）的特殊DNA元件的甲基化水平，從而在特定的基因組位、尤其是遺傳多樣性高的區(qū)域“點燃”新的重組熱點。百邁客生物為該研究提供了轉(zhuǎn)錄組測序及分析服務(wù)！

研究背景

減數(shù)分裂重組是地球上有性生殖生物多樣性的基石。在細胞分裂形成配子（如花粉和卵細胞）的過程中，來自父母本的同源染色體像舞伴一樣配對、交換遺傳物質(zhì)片段，這一過程被稱為“重組交換”（Crossover,?CO）。它不僅打亂并重排了基因，創(chuàng)造出新的遺傳組合，還像“分子膠水”一樣確保染色體在分裂時能被正確地分離，避免了毀滅性的遺傳錯誤。然而，這個過程并非隨機發(fā)生，而是受到一套極其精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)所控制。在玉米這樣基因組龐大且復(fù)雜的作物中，重組事件往往集中在特定的“熱點”區(qū)域，而廣闊的基因組區(qū)域則鮮有重組發(fā)生，如同“冰封”的大陸，這極大地限制了育種家利用優(yōu)異基因資源的能力。近年來，表觀遺傳學(xué)，尤其是DNA甲基化，被認(rèn)為是調(diào)控重組的關(guān)鍵因素之一，但其具體機制仍充滿謎團。

研究內(nèi)容及結(jié)果

1、mop1改變雌雄減數(shù)重組格局

構(gòu)建群體與CO定位

• 作者在B73×Mo17雜交背景下，做了4個BC1群體：雌WT、雌mop1、雄WT、雄mop1，共423個個體。
• 全基因組3×深度重測序，利用~1.9?SNP/kb的密度，HMM調(diào)用出4048個CO，其中60%的CO區(qū)間<5kb，分辨率很高。

CO?總數(shù)的性別差異（Fig.1d）

• 雌性：WT和mop1每減數(shù)平均CO數(shù)基本相同（約19條，差異不顯著）。
• 雄性：mop1?CO數(shù)略低于WT（約18vs19.4，P=0.058，接近顯著）。
• WT中雌雄CO數(shù)相似；但在mop1中，雄性顯著低于雌性，說明mop1參與調(diào)控雌雄間的重組差異。

染色體尺度的CO分布（Fig.1c,?1e）

用Marey?map畫出遺傳距離與重組率曲線，結(jié)果顯示全基因組的重組率形狀在WT與mop1間總體相似，也與雌雄之間大體相似。但放大單條染色體后，可以看到：尤其在雌mop1中，多條染色體（1,4,5,6,7,8,9）在臂區(qū)CO增加，在著絲粒周CO減少；雄mop1也在多條染色體呈現(xiàn)類似趨勢。

結(jié)論：mop1對總CO數(shù)影響相對溫和，但會在局部區(qū)域重排CO峰谷，且這種效應(yīng)具性別特異性。

圖1?雄性mop1突變體與雌性mop1突變體相比，交叉（CO）數(shù)量減少。

2、CO相關(guān)序列motif的變化

篩選“高分辨率CO”

作者只選CO區(qū)間<2?kb的1835個CO，分別來自四個群體（雌WT?484、雌mop1?417、雄WT?431、雄mop1?503），用來做motif分析。

主要發(fā)現(xiàn)（Fig.2）

• 前五大motif都是富C/G或富A/T的短重復(fù)序列，和之前在玉米、小麥、水稻中CO常見motif一致。
• 定量統(tǒng)計顯示一個細節(jié)：富GC的motif（前三個）的出現(xiàn)頻率在雄mop1中明顯比雄WT低；富AT的motif（后兩個）在雌mop1中的出現(xiàn)頻率高于雌WT。

解讀：mop1使雄性CO更少落在GC-rich區(qū)，而讓雌性CO更偏向AT-rich（往往更開放）區(qū)域，體現(xiàn)出性別特異的序列/染色質(zhì)偏好變化。

圖2?在雄性mop1突變體中，G/C相關(guān)基序的頻率降低，而在雌性mop1交叉互換（COs）中A/T相關(guān)基序的頻率增加。

3、序列多態(tài)性與CO的關(guān)系

SNP密度與CO

• 在雌mop1的CO區(qū)間中，SNP密度明顯高于雌WT；雄性則無顯著差別。
• 把全基因組細分不同SNP密度區(qū)間，統(tǒng)計CO頻率：

雌WT：CO?頻率在~7?SNP/kb?達峰；

雌mop1：峰值移動到~13?SNP/kb；

SNP>20/kb?時CO頻率接近0，呈明顯“倒?U?型”，存在上限閾值。

InDel與CO

• mop1與WT之間，CO區(qū)域的InDel數(shù)量/長度無顯著差別。
• CO對InDel的容忍度很低：4?InDel/kb左右達到峰值，達到12個?InDel/kb時幾乎沒有CO，說明InDel比SNP更干擾重組。

結(jié)論：存在一個“適中多態(tài)性”窗口，既不能太低（重組驅(qū)動力不足），也不能太高（同源配對困難）。在雌mop1中，這個SNP閾值被顯著抬高（從7→13?SNP/kb），說明RdDM缺失讓雌性減數(shù)更能容忍高多態(tài)背景下的CO。

圖3?mop1基因，尤其在雌性個體中，傾向于在遺傳多樣性較高的區(qū)域引入新的交叉（CO）位點。

4、CO與轉(zhuǎn)座子，尤其MITEs的緊密關(guān)系

CO與基因/TE的位置關(guān)系（Fig.4a）：1835個高分辨率CO中，約69%位于基因體或2kb上下游，其中44.3%同時與TE重疊。

不同TE類型與CO的相關(guān)性（Fig.4b–c）：按1Mb窗口算CO數(shù)與TE覆蓋度：CO與LTR/Gypsy強負相關(guān)（主要在周圍冷區(qū)）。與LINE、TIR、Helitron、MITE均正相關(guān)，其中MITE的正相關(guān)最強。

MITEs與CO直接重疊的比例（Fig.4d）：隨機選1835個等長區(qū)：僅1.5%與MITE重疊；而CO區(qū)中：雌WT：33.8%CO?與MITE重疊；雌mop1：升到39.3%；雄WT：31.8%；雄mop1：34.7%。?說明：CO極度偏愛MITEs，且mop1尤其在雌性中進一步加強這種偏好。

哪類MITE更“吸CO”？（Fig.4e）：在MITE子家族中，**DTA（hAT類）和DTH（Tourist/PIF-Harbinger類）**最常與CO重疊，占比明顯高于其他子家族。

CO熱點與冷點（Fig.5）

• CO熱點：重組率≥全基因組均值5倍的5kb區(qū)間?？倲?shù)在四個群體為391–525個。它們多數(shù)位于染色體兩端：39.1%?在前10Mb，63.9%在前20Mb。熱點2kb區(qū)內(nèi)，~65%附近有MITEs，而附近是LTR的比例很低。
• CO冷點：≥1Mb無任何CO的大區(qū)間。四個群體分別有~1167–1310個，絕大多數(shù)位于著絲粒周，且在不同群體間高度保守。冷點幾乎都與LTR?retrotransposons重疊，與MITEs卻很少重疊。

總結(jié)：MITEs≈重組熱點的標(biāo)志；LTR?retrotransposons≈穩(wěn)定冷點骨架。mop1通過調(diào)控MITEs，精細地改寫了部分熱點，而不改變那些“固有冷點”。

圖4 交叉變異（COs）與微RNA元件（MITEs）相關(guān)聯(lián)，在mop1突變體中觀察到更高的富集程度

圖5 交叉位點（CO）在MITE序列附近富集，而冷點則與LTR逆轉(zhuǎn)座子相關(guān)聯(lián)

5、mop1通過MITEs上的局部去甲基化+開放染色質(zhì)引入新CO

CO區(qū)DNA甲基化總體特征（Fig.6a）

• 與隨機區(qū)相比，CO附近的CG/CHG甲基化大幅降低（CG:?23.8%vs78.3%；CHG:?12.4%vs60.4%），說明CO天然偏向低甲基化區(qū)域。
• CG/CHG：mop1和WT在CO區(qū)沒有顯著差異。
• CHH：WT中CO區(qū)CHH與隨機區(qū)相當(dāng)，而在mop1中顯著降低。也就是mop1主要在CO區(qū)進一步清空CHH甲基化。

DMR與CO的重疊情況（Fig.6b–c）

在雄mop1與WT花藥甲基化數(shù)據(jù)中，作者找到3189個CG?DMR、4800個CHG?DMR、13864個CHH?DMR，其中大多數(shù)是低甲基化（hypo）。這些成千上萬DMR中，與CO±2kb重疊的不到1%，其中CG：9/2749；CHG：30/4110；CHH：101/12061。且這些與CO重疊的DMR，絕大部分都位于?基因2kb上下游區(qū)域。

這些DMR上到底是哪些TE？（Fig.6d）在“DMR+CO”雙重重疊的TE中，MITEs占比最高，明顯高于僅有DMR或無DMR/CO的TE。這說明：mop1引起的CO變化主要集中在MITEs，尤其是靠近基因的MITEs上。

MITEs上的甲基化&組蛋白標(biāo)記分組分析（Fig.6e–f）

• 按是否與DMR/CO重疊，把MITEs分4類：既有DMR又有CO；有DMR無CO；無DMR有CO；都沒有。
• 結(jié)果：在mop1中，類別1的MITEs?CHG/CHH甲基化降低最明顯；同時，類別1上H2A.Z、H3K27ac、H3K56ac、H3K9ac活性標(biāo)記最高；完全沒有DMR/CO的MITEs這些標(biāo)記最低。即：“真正變成CO熱點”的MITEs=低甲基化+高H2A.Z+高?H3乙?；?位于基因附近。

49kb典型區(qū)域的可視化例子（Fig.6g）

• 染色體9上49?kb區(qū)間中有兩個CHH低甲基化DMR：
• 紅框：一個DMR?同時有?MITE+CO，且H2A.Z、H3?acetylation高，H3K27me3低，mop1中還伴隨CG/CHG降低；
• 藍框：另一個DMR也有MITE，卻沒有CO，CG/CHG一直高，且H3K27me3高、H3Ac低。
• 這對比說明：單靠CHH降低不夠，還要配合整體開放染色質(zhì)（低CG/CHG+高H2A.Z/H3Ac+低H3K27me3），MITEs才會真實變成CO熱點。

圖6 mop1可能通過局部降低具有開放染色質(zhì)標(biāo)記的MITE序列上的DNA甲基化水平
引入新的交叉（CO）位點

6、基因表達和CO干涉：ASY4下調(diào)，但干涉基本不變

RNA-seq：減數(shù)基因表達變化

• 在幼花藥中，mop1vsWT?共有186個上調(diào)、199個下調(diào)DEG。
• 若只看41個減數(shù)相關(guān)基因：只有軸蛋白ASY4顯著下調(diào)；ZYP1、ZIP4接近顯著下調(diào)。
• 這些基因負責(zé)軸/聯(lián)會復(fù)合體結(jié)構(gòu)和CO干涉，Arabidopsis中它們?nèi)笔孋O向染色體臂端偏移。

DEG與DMR、CO的關(guān)系

只有極少部分DEG附近有?DMR，且沒有任何CO與這些DEG的DMR?重疊，說明?MITEs去甲基化帶來的新CO不必然改變附近基因的轉(zhuǎn)錄。

CO干涉分析

作者用crossover?coefficient（CoC）分析干涉強度，發(fā)現(xiàn)：mop1雌雄的干涉與WT基本無顯著差異，只是雌mop1干涉略有減弱趨勢。因此，CO干涉變化不是驅(qū)動CO重排的主要原因。

解釋：mop1的主要作用，是通過局部改變MITEs的表觀狀態(tài)+略微削弱軸/SC?組件來調(diào)整CO的位置，而不是大幅改變CO總數(shù)或經(jīng)典的干涉模型。

研究總結(jié)

在機制層面，mop1通過RdDM通路主要清除基因附近MITEs的CHH（并部分?CG/CHG）甲基化，在本就偏開放的MITE區(qū)促進H2A.Z和H3?acetylation富集，從而讓這些TE成為新的CO熱點。性別差異：這一作用在雌性中更強——雌mop1?不僅保留CO總數(shù)，還把CO推向高SNP、MITE富集的開放區(qū)域，提高了對序列多態(tài)性的容忍度。結(jié)構(gòu)蛋白貢獻：mop1還伴隨軸蛋白ASY4下調(diào)，可能進一步改變CO在染色體上的分布，而對CO干涉整體影響不大。

在應(yīng)用前景方面，提示可以通過精細調(diào)控MITEs附近的甲基化/表觀狀態(tài)，而不是粗暴打掉全基因組甲基化，來在作物中局部提升重組率；有望用于玉米及其他TE-rich作物中打破連鎖拖帶、提高育種重組效率、利用“中度多態(tài)區(qū)域”的隱藏遺傳變異。

以上內(nèi)容來源于清同趣科研，侵刪

研究背景：

細胞質(zhì)雄性不育（CMS，花粉不育但雌蕊能正常發(fā)育）是高等植物中的常見現(xiàn)象，表現(xiàn)為母系遺傳。CMS廣泛應(yīng)用于作物雜交育種，以避免額外的人力物力去人工去雄，因此，CMS具有重要的理論和商業(yè)價值。植物CMS是由核線粒體相互作用介導(dǎo)的，不育性狀的產(chǎn)生來自線粒體基因的表達，但不育性狀可以通過核恢復(fù)育性基因得到恢復(fù)，產(chǎn)生育性部分恢復(fù)的表型。目前造成育性不穩(wěn)定的遺傳修飾的分子機制仍然不清楚。本研究欲通過BSR的策略尋找引起玉米育性不穩(wěn)定的候選基因。

材料選?。?/span>

Jing724和 MD32（CMS-S：S型細胞質(zhì)雄性不育系）為親本，雜交得到F1群體，再以Jing724為回交親本，構(gòu)建BC4群體，群體大小462。選取BC4群體中極端30個完全雄性不育植株的花粉，分別提取RNA，并等量混合構(gòu)建不育池S，同理選取30個育性部分恢復(fù)植株的花粉，構(gòu)建育性部分恢復(fù)池F。
測序平臺：Illumina HiseqTM2500，PE125
測序數(shù)據(jù)：150M clean reads

主要結(jié)果：

1、育性分析：FIL-B（育性不穩(wěn)定系）分為育性部分恢復(fù)的植株和完全不育植株，本項目所構(gòu)建的BC4群體462個子代中有14.9% 的植株為育性部分恢復(fù)的表型。育性部分恢復(fù)植株的花粉大小小于正?；ǚ?，大于完全不育植株的花粉（Fig 1.）。經(jīng)I2-KI染色后的不育花粉表現(xiàn)出形態(tài)的不規(guī)則和染色的異常（Fig 2.）。

Fig 1. FIL-B花粉展示

A：Jing724 和FIL-B （育性不穩(wěn)定系，包括育性部分恢復(fù)植株和完全不育植株） 在抽穗6天后的穗；B： A圖中各植株穗上的花粉. 其中紅色的標(biāo)尺代表 3 cm

Fig 2. I2-KI染色后的花粉

A: 正?；ǚ? B: 育性部分恢復(fù)花粉；C：不育花粉

2、顯微鏡下觀察花粉小孢子：在育性部分恢復(fù)的植株中只有一部分的小孢子呈現(xiàn)在正常形態(tài)，而在不育植株中無正常形態(tài)小孢子。（Fig 3.）

Fig 3. 花粉小孢子的顯微觀察
A: 正?；ǚ? B: 育性部分恢復(fù)花粉；C：不育花粉

3、混池間差異基因分析：本項目以B73為參考基因組，將F池和S池獲得的89M和61M clean reads進行比對。F池和S池的唯一比對效率為72.79% 和69.17%，表達的基因數(shù)目分別為31,905和31,895。獲得混池間的差異基因數(shù)目3,672個，在F池中上調(diào)表達的有3548個，下調(diào)表達的有124個，這些基因共3540個通過NR, Swiss-Prot, GO, COG和 KEGG數(shù)據(jù)庫得到注釋。

4、BSR關(guān)聯(lián)分析：與參考基因組比對后，F(xiàn)池和S池分別獲得171,594和 170,820個 SNP，選取混池間差異的SNP位點，進行ED關(guān)聯(lián)分析，共得到5個候選區(qū)域（Fig 4.），結(jié)合數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果及轉(zhuǎn)錄組差異基因的結(jié)果，最終獲得12個候選基因（Table 2、Table 3）。

Fig 4. ED關(guān)聯(lián)分析結(jié)果圖
A: 各染色體上SNP的ED值; B: 2號染色體上SNP的ED值；C：各染色體上SNP經(jīng)擬合后的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果；B: 2號染色體上SNP經(jīng)擬合后的的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，其中紅色的虛線代表閾值線（99百分位法計算得到），黑色的實線代表擬合曲線

5、關(guān)聯(lián)基因的qPCR驗證：
本研究選取6個與蛋白相關(guān)的候選基因，通過qPCR的方法驗證RNA-seq結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)在育性部分恢復(fù)和不育兩種表型中，這6個候選基因出現(xiàn)4-8倍不同水平的差異表達。

Fig 5. qPCR驗證結(jié)果

6、KASP驗證：
本研究選取BC4群體中50株育性部分恢復(fù)植株和50株不育植株，分別提取DNA，對候選的兩個蛋白基因共4個SNP位點進行KASP驗證，發(fā)現(xiàn)在不同的表型下會出現(xiàn)不同的基因型，再次暗示這兩個基因很可能是與育性不穩(wěn)定相關(guān)。

Fig 6. KASP驗證結(jié)果

文章亮點：

1、研究性狀雄性不育在育種工作中具有重大意義，算得上熱點研究。
2、BSR定位結(jié)果準(zhǔn)確：轉(zhuǎn)錄組BSR不僅能實現(xiàn)SNP水平的定位，同時能從基因的差異表達水平進一步縮小候選范圍，定位結(jié)果相對精細。
3、驗證內(nèi)容豐富：從RNA水平（qPCR）和DNA水平（KASP）驗證，只為拿到候選基因。

參考文獻：

Su A, Song W, Xing J, et al. Identification of Genes Potentially Associated with the Fertility Instability of S-Type Cytoplasmic Male Sterility in Maize via Bulked Segregant RNA-Seq[J]. PloS one, 2016, 11(9): e0163489.